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Technologie de la production d'insuline

L'insuline est l'une des hormones produites par le corps humain, en particulier le pancréas. La violation de la sécrétion de cette substance entraîne l'apparition d'une maladie aussi grave que le diabète. Pour son traitement, utiliser une hormone synthétique qui a été isolée pendant longtemps du pancréas du bétail. Alnako utilise depuis longtemps la technologie de la production d’insuline avec l’aide d’une bactérie très commune: E. coli (Escherichia coli) ou champignon de levure. L'utilisation de cette méthode évite les réactions allergiques causées par une protéine étrangère ayant une légère différence avec l'humain.

Schéma technologique

La technologie de la production d'insuline comprend toutes les principales étapes de la production de produits biotechnologiques. Le résultat est un produit final cristallin, qui est ensuite utilisé pour préparer des solutions injectables utilisées dans le traitement des formes sévères du diabète sucré de type I et de type II. L'effet principal de cette hormone dans l'organisme se manifeste par une diminution du taux de glucose contenu dans le sang.

Les étapes de la production d'insuline seront les suivantes:

  • Préliminaire Elle effectue des opérations telles que la préparation et la purification de l'eau et de l'air, le nettoyage des installations de production et la stérilisation du matériel, la vérification du personnel, le traitement des mains et la livraison de chaussures et de vêtements stériles. Au stade préliminaire également, la synthèse chimique primaire des chaînes de molécules est réalisée à partir de laquelle la protéine insuline sera assemblée. Dans la chaîne A, il y a 21 résidus d'acides aminés et dans la chaîne B-30.
  • Préparation de solutions nutritives et de culture cellulaire. Pour forcer une cellule vivante à produire le composé nécessaire, elle introduit le gène correspondant. Pour cela, les cellules plasmidiques sont coupées par des enzymes spéciales - restrictives et cousues par des gènes, qui codent pour la synthèse des composés nécessaires. Ensuite, par un procédé de microinjection, le plasmide modifié retourne dans la cellule.
  • Culture de suspension cellulaire. Les cellules génétiquement modifiées sont placées dans une solution nutritive qui contient tous les ingrédients nécessaires à la croissance et à la reproduction et qui est stérilisée. La culture se déroule dans des bioréacteurs spéciaux, où de l'air pré-purifié est fourni. Périodiquement, une certaine quantité de solution nutritive est ajoutée au réacteur et en même temps, le même volume de la suspension cellulaire est retiré.
  • Répartition de la culture. La séparation des cultures de fluides et de cellules se fait par sédimentation (sédimentation) dans des sédiments spéciaux, puis par filtration, ce qui permet de préserver au maximum l'intégrité des cellules.
  • Purification chromatographique de la substance. Elle est réalisée sur le matériel approprié, en utilisant diverses méthodes, notamment la chromatographie frontale, l’échange d’anions et la perméation de gel.
  • Obtention d'une molécule de protéine. Au stade biotechnologique, la synthèse d'une molécule d'insuline non préparée se produit. Et les deux composantes de ses chaînes. Leur réticulation est effectuée après oxydation et pliage des chaînes résultantes, conduisant à la formation de ponts disulfure.
  • Le séchage par sublimation dans un four spécial, après quoi la préparation cristalline obtenue est vérifiée pour vérifier sa conformité à la norme, emballée, étiquetée et expédiée au consommateur.

Notre société, à des conditions avantageuses, propose des lignes de production finies où l’ensemble de la technologie de production d’insuline est pleinement respectée. Grâce à des calculs précis, à un support technique et informatif et à la formation du personnel dans le cadre d'un programme complet, l'entreprise sera rentable et ses produits sont recherchés.

De quoi produire de l'insuline

L'insuline est le principal médicament pour traiter le diabète sucré de type 1. Parfois, il est également utilisé pour stabiliser l'état du patient et améliorer son état de santé dans le second type de maladie. Cette substance, par sa nature, est une hormone capable à de faibles doses d’influencer le métabolisme des glucides. Normalement, le pancréas produit suffisamment d'insuline, ce qui aide à maintenir le taux physiologique de sucre dans le sang. Mais avec des troubles endocriniens graves, les injections d'insuline deviennent souvent la seule chance d'aider un patient. Le prendre oralement (sous forme de comprimés), malheureusement, est impossible, car il s'effondre complètement dans le tube digestif et perd sa valeur biologique.

Variantes de l'obtention d'insuline pour la pratique médicale

Beaucoup de diabétiques, à coup sûr, ont déjà posé une question, à partir de quoi l'insuline appliquée à des fins médicales? Actuellement, le plus souvent, ce médicament est obtenu à l'aide de méthodes de génie génétique et de biotechnologie, mais parfois il est extrait de matières premières d'origine animale.

Préparations obtenues à partir de matières premières d'origine animale

Obtenir cette hormone du pancréas des porcs et des bovins est une technologie ancienne qui est utilisée très rarement aujourd'hui. Cela est dû à la faible qualité du médicament, à sa tendance à provoquer des réactions allergiques et à un degré de purification insuffisant. Le fait est qu'une hormone étant une substance protéique, elle consiste en un ensemble spécifique d'acides aminés.

Au début et au milieu du 20ème siècle, quand il n'y avait pas de médicaments similaires, même une telle insuline était une avancée en médecine et permettait de porter le traitement des diabétiques à un nouveau niveau. Les hormones obtenues par cette méthode réduisent le taux de sucre dans le sang, mais elles provoquent souvent des effets secondaires et des allergies. Les différences dans la composition des acides aminés et des impuretés dans le médicament affectent l'état des patients, en particulier dans les catégories de patients les plus vulnérables (enfants et personnes âgées). Une autre raison de la mauvaise tolérance de cette insuline est la présence de son précurseur inactif dans le médicament (la proinsuline), dont il était impossible de se débarrasser dans cette variation du médicament.

À notre époque, il existe des insulines de porc améliorées qui ne présentent pas ces inconvénients. Ils sont obtenus à partir du pancréas du porc, mais après cela, ils reçoivent un traitement et une purification supplémentaires. Ils sont multi-composants et contiennent des substances auxiliaires.

Ces médicaments sont bien tolérés par les patients et ne provoquent pas d'effets indésirables, ils ne suppriment pas l'immunité et réduisent efficacement le taux de sucre dans le sang. L'insuline bovine n'est pas utilisée en médecine aujourd'hui, car en raison de sa structure étrangère, elle affecte négativement les systèmes immunitaires et autres du corps humain.

Insuline génétiquement modifiée

L'insuline humaine, utilisée chez les diabétiques, à l'échelle industrielle est obtenue de deux manières:

  • par traitement enzymatique de l'insuline porcine;
  • en utilisant des souches d'Escherichia coli ou de levure génétiquement modifiées.

Lorsque des modifications physico-chimiques de la molécule d'insuline porcine sous l'action d'enzymes spéciales deviennent identiques à l'insuline humaine. La composition en acides aminés de la préparation obtenue ne diffère pas de la composition de l'hormone naturelle produite chez l'homme. Dans le processus de production, le médicament est hautement purifié, il ne provoque donc pas de réactions allergiques et d'autres manifestations indésirables.

Mais le plus souvent, l'insuline est obtenue à l'aide de microorganismes modifiés (génétiquement modifiés). Les bactéries ou les levures à l'aide de méthodes biotechnologiques sont modifiées de telle manière qu'elles peuvent produire elles-mêmes de l'insuline.

Il existe 2 méthodes pour obtenir de l'insuline comme celle-ci. Le premier d'entre eux repose sur l'utilisation de deux souches différentes (espèces) d'un seul microorganisme. Chacune d'elles ne synthétise qu'une seule chaîne de la molécule d'ADN de l'hormone (il n'y en a que deux et elles sont torsadées en spirale). Ensuite, ces chaînes sont connectées et dans la solution résultante, il est déjà possible de séparer les formes actives de l'insuline de celles qui ne portent aucune signification biologique.

La deuxième façon d'obtenir le médicament avec E. coli ou la levure est basée sur le fait que le microbe produit d'abord de l'insuline inactive (c'est-à-dire son précurseur, la proinsuline). Ensuite, à l'aide du traitement enzymatique, cette forme est activée et utilisée en médecine.

Tous ces processus sont généralement automatisés, l'air et toutes les surfaces de contact avec les ampoules et les flacons sont stériles et les conduites avec l'équipement sont hermétiquement fermées.

Les méthodes de la biotechnologie permettent aux scientifiques de réfléchir à des solutions alternatives au problème du diabète sucré. Par exemple, à ce jour, des études précliniques sur la production de cellules bêta artificielles du pancréas, qui peuvent être obtenues par des techniques de génie génétique, sont menées. Peut-être qu'à l'avenir, ils seront utilisés pour améliorer le fonctionnement de ce corps chez une personne malade.

Composants supplémentaires

La production d'insuline sans substances auxiliaires dans le monde moderne est presque impossible à imaginer, car elle permet d'améliorer ses propriétés chimiques, de prolonger le temps d'action et d'atteindre un degré élevé de pureté.

Par ses propriétés, tous les ingrédients supplémentaires peuvent être répartis dans les classes suivantes:

  • Prolongateurs (substances utilisées pour assurer une plus longue durée du médicament);
  • composants désinfectants;
  • stabilisants, grâce à quoi une acidité optimale est maintenue dans la solution médicamenteuse.

Prolongateurs Additifs

Il y a l'insuline à action prolongée dont l'activité biologique dure de 8 à 42 heures (selon le groupe de médicament). Cet effet est obtenu en ajoutant à la solution injectable des substances spéciales - des prolongateurs. Le plus souvent, l'un de ces composés est utilisé à cette fin:

Les protéines qui prolongent l'action du médicament subissent une purification détaillée et sont peu allergènes (par exemple, la protamine). Les sels de zinc n'ont pas non plus d'effet négatif sur l'activité de l'insuline ou sur le bien-être de la personne.

Ingrédients antimicrobiens

Les désinfectants dans la composition de l'insuline sont nécessaires pour que, pendant le stockage et l'utilisation, ils ne multiplient pas la flore microbienne. Ces substances sont des conservateurs et assurent la sécurité de l'activité biologique du médicament. De plus, si un patient entre une hormone d'un flacon à lui seul, le médicament peut lui suffire pour quelques jours. En raison de la qualité des composants antibactériens, il n'aura pas à jeter le produit inutilisé en raison de la possibilité théorique de reproduction dans une solution de microbes.

En tant que désinfectant dans la production d'insuline, ces substances peuvent être utilisées:

Pour la production de chaque type d'insuline, certains désinfectants conviennent. Leur interaction avec l’hormone est nécessairement étudiée au stade des essais précliniques, car le conservateur ne doit pas briser l’activité biologique de l’insuline ou affecter d’une manière ou d’une autre ses propriétés.

L'utilisation de conservateurs dans la plupart des cas vous permet d'injecter l'hormone sous la peau sans son traitement préliminaire avec de l'alcool ou d'autres antiseptiques (le fabricant mentionne généralement cela dans le manuel). Cela simplifie l'administration du médicament et réduit le nombre de manipulations préparatoires avant l'injection proprement dite. Mais cette recommandation ne fonctionne que si la solution est injectée avec une seringue à insuline individuelle avec une aiguille fine.

Stabilisants

Les stabilisants sont nécessaires pour garantir que le pH de la solution est maintenu à un niveau prédéterminé. Le niveau d'acidité dépend de la sécurité du médicament, de son activité et de la stabilité de ses propriétés chimiques. Pour la production d'une hormone injectable pour les diabétiques, les phosphates sont généralement utilisés à cette fin.

Pour les insulines contenant du zinc, les stabilisants en solution ne sont pas toujours nécessaires, car les ions métalliques aident à maintenir l'équilibre nécessaire. Si elles sont encore appliquées, d'autres composés chimiques sont utilisés à la place des phosphates, car une combinaison de ces substances entraîne des précipitations et l'inaptitude du médicament. Une des propriétés importantes de tous les stabilisants est la sécurité et l’impossibilité de réagir à l’insuline.

Le choix d'injecter des médicaments pour le diabète pour chaque patient doit être effectué par un endocrinologue compétent. La tâche de l’insuline n’est pas seulement de maintenir une glycémie normale, mais aussi de ne pas nuire à d’autres organes et systèmes. Le médicament doit être chimiquement neutre, peu allergène et de préférence abordable. Il est également très pratique que l'insuline sélectionnée puisse être mélangée avec ses autres versions à la durée de l'action.

Ce qui rend l'insuline pour les diabétiques: production moderne et méthodes d'obtention

L'insuline est une hormone qui joue un rôle crucial dans le fonctionnement normal du corps humain. Il est produit par les cellules du pancréas et favorise l'absorption du glucose, principale source d'énergie et principal aliment du cerveau.

Mais parfois, pour une raison ou une autre, la sécrétion d'insuline dans le corps est considérablement réduite ou cesse complètement, comme c'est le cas et comment aider. Cela entraîne une perturbation grave du métabolisme des glucides et le développement d'une maladie aussi dangereuse que le diabète.

Sans traitement opportun et adéquat, cette maladie peut avoir de graves conséquences, allant jusqu’à la perte de la vision et des membres. La seule façon de prévenir l'apparition de complications est l'injection régulière d'insuline obtenue artificiellement.

Mais qu'est-ce qui fait de l'insuline pour les diabétiques et comment affecte-t-elle le corps du patient? Ces questions intéressent de nombreuses personnes atteintes de diabète sucré. Pour comprendre cela, il est nécessaire de prendre en compte toutes les méthodes d'obtention de l'insuline.

Variétés

Les préparations modernes d'insuline diffèrent par les caractéristiques suivantes:

  • Source d'origine;
  • Durée de l'action;
  • pH de la solution (acide ou neutre);
  • Présence de conservateurs (phénol, crésol, phénol-crésol, méthylparaben);
  • La concentration en insuline est de 40, 80, 100, 200, 500 U / ml.

Ces signes affectent la qualité du médicament, son coût et le degré d'exposition au corps.

Sources d'information

Selon la source de la préparation, les préparations d'insuline sont divisées en deux groupes principaux:

Animaux Ils sont obtenus à partir du pancréas de bovins et de porcs. Ils peuvent être dangereux, car ils provoquent souvent de graves réactions allergiques. Cela est particulièrement vrai pour l'insuline bovine, qui contient trois acides aminés non caractéristiques de l'homme. L'insuline de porc est plus sûre, car elle ne diffère que par un seul acide aminé. Par conséquent, il est plus souvent utilisé dans le traitement du diabète sucré.

Humain Ils sont de deux sortes: analogues à l'homme ou semi-synthétiques, dérivés de l'insuline porcine par transformation enzymatique et recombinants humains ou ADN, qui produisent des bactéries d'Escherichia coli en raison des résultats du génie génétique. Ces préparations d'insuline sont complètement identiques à l'hormone produite par le pancréas humain.

Aujourd'hui, dans le traitement du diabète, l'insuline, d'origine humaine et animale, est largement utilisée. La production moderne d'insuline chez l'animal suppose le plus haut degré de purification du médicament.

Cela permet de l'éliminer des impuretés indésirables telles que la proinsuline, le glucagon, la somatostatine, les protéines, les polypeptides pouvant entraîner des effets secondaires graves.

La meilleure préparation d'origine animale est l'insuline monopole moderne, c'est-à-dire produite avec l'isolement du "pic" de l'insuline.

Durée de l'action

La production d'insuline est réalisée selon différentes technologies, ce qui permet d'obtenir des préparations de durée d'action différente, à savoir:

  • action ultracourte;
  • action brève;
  • action prolongée
  • durée moyenne de l'action;
  • longue durée d'action
  • action combinée.

Insulines d'action ultracourte. Ces préparations d'insuline diffèrent par le fait qu'elles commencent à agir immédiatement après l'injection et qu'elles atteignent leur maximum après 60 à 90 minutes. Leur temps d'action total ne dépasse pas 3-4 heures.

Il existe deux principaux types d’insuline à action ultracourte: Lizpro et Aspart. La préparation de l'insuline Lizpro est réalisée en réarrangeant deux résidus d'acides aminés dans la molécule d'hormone, à savoir la lysine et la proline.

Grâce à une telle modification de la molécule, il est possible d'éviter la formation d'hexamères et d'accélérer sa décomposition en monomères, ce qui signifie améliorer l'assimilation de l'insuline. Cela vous permet d'obtenir un produit d'insuline qui pénètre dans le sang du patient trois fois plus rapidement que l'insuline humaine naturelle.

Une autre action de l'insuline ultracourte est Aspart. Les méthodes d'obtention de l'asparta-insuline sont à bien des égards similaires à la production de Lyspro, mais dans ce cas seulement, la proline est remplacée par de l'acide aspartique chargé négativement.

En outre, comme Lizpro, Aspart se décompose rapidement en monomères et est donc presque instantanément absorbé dans le sang. Toutes les préparations d'insuline à action ultracourte peuvent être administrées juste avant les repas ou immédiatement après la prise.

Insulines à courte durée d'action. Ces insulines sont des solutions tampons à pH neutre (de 6,6 à 8,0). Il est recommandé de les administrer en tant qu'insuline par voie sous-cutanée, mais si nécessaire, des injections intramusculaires ou des compte-gouttes sont autorisés.

Ces préparations d'insuline commencent à agir dès 20 minutes après l'ingestion. Leur action dure relativement peu de temps, pas plus de 6 heures et atteint son maximum après 2 heures.

L'insuline à courte durée d'action est principalement produite pour le traitement des patients diabétiques en milieu hospitalier. Ils aident efficacement les patients atteints de coma et de prikoma diabétiques. En outre, ils permettent la détermination la plus précise de la dose d'insuline nécessaire pour le patient.

Insuline de durée moyenne d'action. Ces médicaments se dissolvent beaucoup plus que l'insuline à courte durée d'action. Par conséquent, ils arrivent plus lentement dans le sang, ce qui augmente considérablement leur effet hypoglycémiant.

La préparation de l'insuline de durée d'action moyenne est obtenue en introduisant dans leur composition un agent prolongateur spécial - le zinc ou la protamine (isophane, protafan, basal).

De telles préparations d'insuline sont disponibles sous forme de suspensions, avec une certaine quantité de cristaux de zinc ou de protamine (le plus souvent de la protamine d'Hagedorn et de l'isophane). Les prolongateurs augmentent de manière significative le temps d'absorption du médicament par le tissu sous-cutané, ce qui augmente de manière significative le temps pendant lequel l'insuline pénètre dans le sang.

Insulines à action prolongée. C'est l'insuline la plus moderne, rendue possible par le développement de la technologie de recombinaison de l'ADN. La toute première préparation à l'insuline depuis longtemps était Glargin, qui est un analogue exact de l'hormone produite par le pancréas humain.

Pour le produire, une modification complexe de la molécule d'insuline est réalisée, impliquant le remplacement de l'asparagine par la glycine et l'ajout ultérieur de deux résidus d'arginine.

Glargine est réalisé sous la forme d'une solution limpide à pH 4. Cette caractéristique de pH acide conduit à une plus grande stabilité des hexamères d'insuline, et ainsi fournir une absorption prolongée et prévisible du médicament dans le sang du patient. Toutefois, en raison du pH acide, il est déconseillé de combiner Glargin avec une insuline à courte durée d'action, dont le pH est généralement neutre.

La plupart des préparations d'insuline ont un "pic d'action", lorsqu'elles atteignent la concentration d'insuline la plus élevée dans le sang du patient. Cependant, la principale caractéristique de Glargin est qu'il n'a pas de pic d'action explicite.

Une seule injection par jour est suffisante pour fournir au patient un contrôle glycémique fiable et sans pic pendant les 24 heures suivantes. Ceci est dû au fait que la glargine est absorbée par le tissu sous-cutané à la même vitesse pendant toute la période d'action.

Les préparations d'insuline à longue durée d'action sont produites sous diverses formes et peuvent procurer au patient un effet hypoglycémiant allant jusqu'à 36 heures d'affilée. Cela aide à réduire de manière significative le nombre d'injections d'insuline par jour et, par conséquent, à réduire de manière significative la vie des patients diabétiques.

Il est important de noter que Glargin est recommandé uniquement pour les injections sous-cutanées et intramusculaires. Ce médicament ne convient pas au traitement du comatose ou de la précomatite chez les patients atteints de diabète sucré.

Préparations combinées Ces médicaments sont disponibles sous la forme d'une suspension comprenant une solution neutre d'insuline à action courte et de l'insuline à action moyenne avec l'isophane.

De tels médicaments permettent au patient d'administrer de l'insuline de durée d'action variable dans leur corps à l'aide d'une seule injection, ce qui signifie qu'il faut éviter des injections supplémentaires.

Composants de désinfection

La désinfection des préparations d'insuline est d'une grande importance pour la sécurité du patient, car elles sont injectées par voie injectable dans l'organisme et sont transportées avec le flux sanguin vers tous les organes et tissus internes.

Certaines substances ajoutées à la composition d'insuline non seulement comme désinfectant, mais aussi comme conservateur possèdent une certaine action bactéricide. Ceux-ci comprennent le crésol, le phénol et le parabenzoate de méthyle. En outre, un effet antimicrobien prononcé est également caractéristique des ions zinc, qui font partie de certaines solutions d'insuline.

La protection multi-niveaux contre les infections bactériennes, obtenue par l'ajout de conservateurs et d'autres agents antiseptiques, aide à prévenir le développement de nombreuses complications graves. Après l'injection répétée d'une aiguille de seringue dans un flacon d'insuline, cela pourrait entraîner une contamination de la préparation par des bactéries pathogènes.

Cependant, les propriétés bactéricides de la solution aident à détruire les micro-organismes nuisibles et à préserver sa sécurité pour le patient. Pour cette raison, les patients atteints de diabète peuvent utiliser la même seringue pour effectuer des injections hypodermiques d’insuline jusqu’à 7 fois de suite.

Un autre avantage d'avoir des conservateurs dans la composition de l'insuline est le manque de nécessité de désinfecter la peau avant l'injection. Mais ceci n'est possible qu'avec l'utilisation de seringues à insuline spéciales équipées d'une aiguille très fine.

Il convient de souligner que la présence de conservateurs dans l’insuline n’affecte pas les propriétés du médicament et est totalement sans danger pour le patient.

Conclusion

À ce jour, l'insuline, obtenue à la fois à l'aide du pancréas des animaux et des méthodes modernes de génie génétique, est largement utilisée pour créer un grand nombre de médicaments.

Les insulines humaines recombinantes d'ADN hautement purifiées, qui ont l'antigénicité la plus faible, sont les plus préférées pour l'insulinothérapie quotidienne et ne provoquent donc aucune réaction allergique. De plus, les médicaments à base d'analogues de l'insuline humaine offrent une qualité et une sécurité élevées.

Les préparations d'insuline sont vendues dans des bouteilles en verre de différentes capacités, scellées hermétiquement avec des bouchons en caoutchouc et recouvertes d'aluminium. En outre, ils peuvent être achetés avec des seringues à insuline spéciales, ainsi que des seringues, particulièrement pratiques pour les enfants.

Actuellement, on développe principalement de nouvelles formes de préparations d'insuline qui seront injectées dans le corps par voie intranasale, c'est-à-dire par la muqueuse nasale.

En combinant l'insuline avec le détergent, il a été possible de créer un médicament en aérosol qui atteindrait la concentration requise dans le sang du patient aussi rapidement que lors d'une injection intraveineuse. En outre, les plus récentes préparations d'insuline orale sont créées et peuvent être prises par la bouche.

A ce jour, ces types d'insuline sont encore au stade de développement ou subissent les tests cliniques nécessaires. Cependant, il est évident que des préparations d’insuline apparaîtront dans un avenir proche, qui n’aura pas besoin d’être injecté avec des seringues.

Les produits d'insuline les plus récents seront produits sous forme de vaporisateurs, qui devront simplement éclabousser la surface muqueuse du nez ou de la bouche pour satisfaire pleinement les besoins en insuline de l'organisme.

De quelle matière est fabriquée l'insuline (fabrication, production, production, synthèse)

L'insuline est un médicament essentiel, elle a révolutionné la vie de nombreuses personnes atteintes de diabète.

Dans toute l'histoire de la médecine et de la pharmacie du XXe siècle, peut-être qu'un seul groupe de médicaments ayant la même importance est possible: les antibiotiques. En plus de l'insuline, ils ont très rapidement pris le médicament et ont aidé à sauver beaucoup de vies humaines.

Journée contre le diabète est marqué par l'initiative de l'Organisation mondiale de la Santé, chaque année depuis 1991 sur l'anniversaire du physiologiste canadien F.Bantinga qui a découvert l'hormone insuline avec Dzh.Dzh.Makleodom. Voyons comment cette hormone est fabriquée.

Quelle est la différence entre les préparations d'insuline les unes des autres?

  1. Degré de nettoyage.
  2. La source du reçu est l'insuline porcine, haussière et humaine.
  3. Les composants supplémentaires inclus dans la solution du médicament sont des conservateurs, des agents prolongeant l'action et d'autres.
  4. Concentration.
  5. pH de la solution.
  6. La possibilité de mélanger des médicaments d'action courte et prolongée.

L'insuline est une hormone produite par des cellules spéciales du pancréas. C'est une protéine double brin qui comprend 51 acides aminés.

Dans le monde, environ 6 milliards d'unités d'insuline sont utilisées chaque année (1 unité correspond à 42 μg de substance). La production d'insuline est de haute technologie et n'est réalisée que par des méthodes industrielles.

Sources de production d'insuline

Actuellement, en fonction de la source de production, l'insuline de porc et les préparations d'insuline humaine sont isolées.

L'insuline de porc a maintenant un très haut degré de purification, a un bon effet hypoglycémiant, il n'y a presque pas de réactions allergiques.

Les préparations d'insuline humaine correspondent parfaitement à la structure chimique de l'hormone humaine. Ils sont généralement produits par biosynthèse en utilisant des technologies génétiquement modifiées.

Les producteurs de grandes entreprises utilisent de telles méthodes de production qui garantissent la conformité de leurs produits à toutes les normes de qualité. De grandes différences dans l'action de l'insuline monocomposant humaine et porcine (c.-à-haute pureté) ont été identifiés par rapport au système immunitaire, selon de nombreuses études, la différence est minime.

Composants auxiliaires utilisés dans la production d'insuline

Dans la fiole avec le médicament contient une solution contenant non seulement l'hormone insuline elle-même, mais aussi d'autres composés. Chacun d'eux joue son rôle spécifique:

  • prolongation du médicament;
  • désinfection de la solution;
  • la présence de propriétés tampons de la solution et le maintien d'un pH neutre (bilan acide-base).

Renouvellement de l'action de l'insuline

Pour créer une insuline à action prolongée, l'un des deux composés, le zinc ou la protamine, est ajouté à la solution d'insuline conventionnelle. Selon cela, toutes les insulines peuvent être divisées en deux groupes:

  • protamine-insuline-protopan, basal insuman, NPH, humuline N;
  • zinc-insuline - insuline-zinc-suspension mono-tardive, ruban adhésif, humuline-zinc.

La protamine est une protéine, mais les réactions indésirables sous forme d'allergies sont très rares.

Pour créer un milieu de solution neutre, un tampon phosphate y est ajouté. Il convient de rappeler que l'insuline contenant des phosphates, strictement interdit de se connecter avec une suspension d'insuline zinc (DSV) en tant que phosphate de zinc avec les précipités et l'effet du zinc-insuline raccourcie de façon imprévisible.

Composants de désinfection

Certains des composés possédant un effet désinfectant sont ceux qui, selon les critères pharmaco-technologiques, devraient être introduits dans la préparation de cette manière. Celles-ci comprennent le crésol et le phénol (les deux ont une odeur spécifique) et le parahydroxybenzoate de méthyle (méthylparaben), qui ne dégage aucune odeur.

L'introduction de l'un de ces conservateurs et provoque une odeur spécifique de certaines préparations d'insuline. Tous les conservateurs dans la quantité dans laquelle ils se trouvent dans les préparations d'insuline n'ont aucun effet négatif.

Les insuline protamine comprennent généralement le crésol ou le phénol. Dans les solutions phénoliques, le phénol ne peut pas être ajouté, car il modifie les propriétés physiques des particules hormonales. Ces médicaments comprennent le méthylparaben. En outre, l’action antimicrobienne est exercée par les ions zinc en solution.

Grâce à cette protection antibactérienne à plusieurs étages à l'aide de conservateurs, le développement de complications possibles est évité, ce qui pourrait être provoqué par une contamination bactérienne avec introduction répétée de l'aiguille dans la fiole avec la solution.

En raison de la présence d'un tel mécanisme de protection, le patient peut utiliser la même seringue pour les injections hypodermiques du médicament pendant 5 à 7 jours (à condition qu'une seule seringue soit utilisée). De plus, les conservateurs permettent de ne pas utiliser d'alcool pour traiter la peau avant l'injection, mais encore une fois seulement si le patient s'injecte lui-même une seringue avec une aiguille fine (insuline).

Etalonnage des seringues à insuline

Dans les premières préparations d'insuline, une seule unité de l'hormone était contenue dans un ml de solution. Plus tard la concentration a été augmentée. La plupart des préparations d'insuline dans les fioles utilisées en Russie contiennent 40 unités dans 1 ml de solution. Les flacons sont généralement marqués du symbole U-40 ou 40 unités / ml.

Les seringues d'insuline destinées à l'utilisation à grande échelle, il suffit pour cela à l'insuline et l'étalonnage sur le principe suivant: à seringue de 0,5 ml d'ensemble, une personne acquiert 20 unités, 0,35 ml correspondant à 10 unités et ainsi de suite.

Chaque marque sur la seringue est égale à un certain volume et le patient sait déjà combien d’unités dans ce volume sont contenues. Ainsi, l'étalonnage des seringues est un étalonnage en volume du médicament, conçu pour utiliser l'insuline U-40. 4 unités d'insuline sont contenues dans 0,1 ml, 6 unités dans 0,15 ml de préparation et ainsi de suite jusqu'à 40 unités, ce qui correspond à 1 ml de solution.

Dans certains pays, l'insuline est utilisée, dont 1 ml contient 100 unités (U-100). Pour ces médicaments, des seringues à insuline spéciales sont produites, similaires à celles décrites ci-dessus, mais elles sont calibrées différemment.

Il prend précisément en compte cette concentration (elle est 2,5 fois supérieure à la concentration standard). Dans ce cas, la dose d'insuline pour le patient reste bien sûr la même, car elle répond aux besoins du corps en une quantité spécifique d'insuline.

Autrement dit, si le patient utilisait auparavant le médicament U-40 et lui administrait 40 unités d'hormone par jour, puis les mêmes 40 unités, il devrait être injecté avec de l'insuline U-100, mais injecter 2,5 fois moins. C'est-à-dire que les mêmes 40 unités seront contenues dans 0,4 ml de la solution.

Malheureusement, tous les médecins et les plus malades ne sont pas au courant. Les premières difficultés ont commencé lorsque certains patients sont passés à l’utilisation d’injecteurs d’insuline (seringues), dans lesquels on a utilisé des stylos philos (cartouches spéciales) contenant de l’insuline U-40.

Si vous tapez une solution étiquetée U-100 dans une telle seringue, par exemple à 20 unités (soit 0,5 ml), ce volume contiendra jusqu'à 50 unités du médicament.

À chaque fois, en remplissant l'insuline de seringues régulières U-100 et en observant la coupure des unités, une personne gagnera une dose 2,5 fois supérieure à celle indiquée au niveau de cette marque. Si ni le médecin ni le patient ne remarquent cette erreur en temps utile, il existe une forte probabilité de développer une hypoglycémie sévère due à une surdose constante du médicament, qui se produit souvent dans la pratique.

D'autre part, il existe parfois des seringues à insuline, calibrées précisément pour le médicament U-100. Si une telle seringue est remplie par erreur avec la solution U-40 habituelle, la dose d'insuline dans la seringue sera 2,5 fois inférieure à celle indiquée près de la marque correspondante sur la seringue.

En conséquence, à première vue, une augmentation inexpliquée du glucose dans le sang est possible. En fait, bien sûr, tout est logique - pour chaque concentration du médicament, il est nécessaire d’utiliser une seringue adaptée.

Dans certains pays, par exemple en Suisse, le plan a été soigneusement étudié, selon lequel une transition compétente vers des préparations d'insuline étiquetées U-100 a été effectuée. Mais cela nécessite un contact étroit entre toutes les parties intéressées: médecins de nombreuses spécialités, patients, infirmiers de tous les départements, pharmaciens, fabricants, autorités.

Dans notre pays, il est très difficile de transférer tous les patients uniquement à l’utilisation de l’insuline U-100, car cela entraînera probablement une augmentation du nombre d’erreurs dans la détermination de la dose.

Utilisation conjointe d'insulines à courte et longue durée d'action

Dans la médecine moderne, le traitement du diabète, en particulier du premier type, se produit généralement au moyen d’une combinaison de deux types d’insuline - une action courte et prolongée.

Pour les patients, il serait beaucoup plus pratique de combiner des médicaments à durée d'action différente dans une seringue et de les injecter simultanément pour éviter un double perçage cutané.

De nombreux médecins ne savent pas ce qui détermine la possibilité de mélanger différentes insulines. Ceci est basé sur la compatibilité chimique et galénique (déterminée par la composition) de l'insuline d'action prolongée et courte.

Il est très important que lors du mélange de deux types de médicaments, le début d'action rapide d'une insuline courte ne se dilate pas ou ne disparaisse pas.

Il est prouvé que la préparation à courte durée d'action peut être combinée en une injection de protamine-insuline et que le début du travail de l'insuline courte n'est pas différé car l'insuline soluble ne se lie pas à la protamine.

Dans le même temps, le fabricant du médicament n'a pas d'importance. Par exemple, l'insuline actrapid peut être associée à l'humuline H ou au protafan. De plus, des mélanges de ces préparations peuvent être stockés.

En ce qui concerne les préparations de zinc-insuline établi depuis longtemps que la suspension d'insuline-zinc (cristal) ne peut pas être relié à une courte insuline, car il se lie avec un excès d'ions zinc et se transforme en une insuline prolongée, parfois partiellement.

Certains patients injectent d'abord un médicament à courte durée d'action, puis, sans retirer les aiguilles sous la peau, changer légèrement de direction et y injecter de l'insuline-zinc.

Dans un tel mode d'administration passe tout à fait un peu de recherche, donc nous ne pouvons pas exclure le fait que, dans certains cas, cette méthode d'injection sous la peau peut se former zinc-insuline complexe et médicaments courte durée d'action, ce qui conduit à une malabsorption de ce dernier.

Par conséquent, il est préférable d'introduire une insuline courte complètement séparée de l'insuline-zinc, pour effectuer deux injections séparées dans les zones cutanées, situées l'une à l'autre à une distance d'au moins 1 cm.

Insuline combinée

Aujourd'hui, l'industrie pharmaceutique produit des préparations combinées contenant de l'insuline à courte durée d'action et de la protamine-insuline dans un pourcentage strictement défini. Ces médicaments comprennent:

Les combinaisons les plus efficaces sont celles dans lesquelles le rapport entre l'insuline courte et prolongée est de 30:70 ou 25:75. Ce rapport est toujours indiqué dans les instructions d'utilisation de chaque préparation particulière.

Ces médicaments conviennent mieux aux personnes qui suivent un régime alimentaire constant et qui ont une activité motrice régulière. Par exemple, ils sont souvent utilisés par les patients âgés atteints de diabète de type 2.

L'insuline combinée ne convient pas à la mise en œuvre d'une thérapie à l'insuline dite "flexible", lorsqu'il devient nécessaire de modifier constamment la posologie de l'insuline à courte durée d'action.

Par exemple, cela devrait être fait en modifiant la quantité de glucides dans les aliments, en réduisant ou en augmentant l'activité physique, etc. Dans ce cas, la dose d'insuline basale (prolongée) ne change pratiquement pas.

Le diabète sucré occupe la troisième place sur la planète en termes de prévalence. Il est à la traîne des maladies cardiovasculaires et de l'oncologie. Selon différentes données, le nombre de personnes atteintes de diabète dans le monde varie de 120 à 180 millions de personnes (soit environ 3% de la population totale de la planète). Selon certaines prévisions, le nombre de patients doublera tous les 15 ans.

Pour mener à bien une insulinothérapie, il suffit d'avoir un seul médicament, de l'insuline à courte durée d'action et une insuline prolongée, qu'ils peuvent combiner entre eux. De plus, dans certains cas (principalement chez les patients âgés), un médicament combiné est nécessaire.

Des recommandations modernes déterminent les critères suivants pour choisir les préparations d'insuline:

  1. Haut degré de purification.
  2. Possibilité de se mélanger avec d'autres types d'insuline.
  3. PH neutre.
  4. Les préparations de la catégorie de l'insuline prolongée doivent avoir une durée d'action de 12 à 18 heures, de sorte qu'il suffit de les injecter deux fois par jour.

Technologie de la production d'insuline humaine en Russie

La production biotechnologique moderne d'insuline est un processus complexe, basé sur la modification génétique des microorganismes. Cette méthode est relativement nouvelle et introduite dans la production dans les années quatre-vingt du siècle dernier. Avec son aide, on obtient un médicament parfaitement compatible avec ce qui est produit dans le corps humain. D'où l'appellation "insuline humaine".

Il convient de noter que ce terme "insuline humaine" provoque parfois plusieurs réactions et hypothèses incorrectes selon lesquelles le médicament est obtenu à partir du corps humain. C'est pour cette raison que la question est souvent posée: "Comment l'insuline produit-elle?" - et d'où vient cette définition.

En effet, jusqu'à récemment, la technologie de production d'insuline était complètement différente. Il était extrait du corps des porcs ou du bétail et nommé en conséquence, par exemple, porc ou bovin. Cependant, cette technologie de production est dépassée et présente un certain nombre de lacunes graves, parmi lesquelles l'impossibilité d'obtenir une substance pure sans impuretés de proinsuline, qui provoque diverses réactions allergiques et la production d'anticorps chez une personne.

Les pharmacies veulent à nouveau profiter des diabétiques. Il existe une drogue européenne moderne et sensée, mais elle reste discrète. Ceci

En outre, en raison de l'augmentation constante du nombre de personnes atteintes de diabète sucré, il n'y a pas suffisamment de matière première animale pour la production d'insuline, ce qui constitue un autre effort pour trouver des méthodes modernes pour l'obtenir par des moyens artificiels.

A ce jour, une préparation humaine ou recombinante est obtenue à partir de souches de levure ou d'Escherichia coli. Ces substances ne sont pas choisies au hasard: lors de leur croissance dans le milieu nutritif, elles produisent une quantité énorme de l'hormone nécessaire. Cela signifie que le processus n’est pas seulement technologique, mais aussi biologique, car la substance nécessaire est produite par des organismes vivants, puis transformée et non synthétisée par des moyens chimiques.

Il convient de noter que la science a traversé un chemin difficile et difficile avant qu'une méthode biotechnologique d'obtention d'un médicament pour les diabétiques ne soit trouvée et introduite dans la production. Pour la première fois, la composition exacte de l'insuline produite par l'homme a été établie dans les années soixante du siècle dernier. Il s'est avéré que ses molécules ont une composition en acides aminés différente de celle de l'acide aminé d'origine animale. Plus tard, des tentatives ont été faites pour remplacer un acide aminé par un autre, en passant, assez réussi, mais très coûteux. Cette méthode était considérée comme non rentable et peu prometteuse non seulement dans notre pays, mais aussi à l’étranger.

Et seulement après deux décennies de dur labeur, il était possible d'obtenir une préparation absolument pure, correspondant parfaitement à ce qui est produit dans le corps d'une personne en bonne santé, ce qui ne provoque pas de réactions de rejet et allergiques.

La production d'insuline humaine est basée sur la méthode du génie génétique, au cours de laquelle un gène est intégré dans la molécule d'ADN de levure, qui détermine la production d'une hormone complètement similaire à celle produite par l'homme. Cette méthode est largement utilisée dans tous les pays développés du monde et vous permet de recevoir des médicaments pour le traitement du diabète de qualité supérieure et en quantité suffisante.

La production d'insuline en Russie est prévue dans un avenir proche. La construction de l'atelier dans l'Oural est déjà en cours. Cependant, actuellement, les médicaments pour le traitement des patients atteints de diabète sucré sont achetés à l'étranger, ce qui représente une dépense énorme pour le budget du pays.

Il convient de noter que la technologie de sa production a déjà été testée en Russie par expérience et que d’excellents résultats ont été obtenus. Nos médicaments domestiques étaient plus efficaces et plus propres. Il ne reste plus qu'à établir le processus de production.

J'ai souffert de diabète pendant 31 ans. Maintenant il va bien. Mais ces capsules sont inaccessibles aux gens ordinaires, elles ne veulent pas vendre de pharmacies, elles ne sont pas rentables pour elles.

Technologie de la production d'insuline

Violation de la sécrétion d'insuline. Utilisation de la chromatographie d'affinité. Le schéma pour obtenir de l'insuline. Expression de la proinsuline dans les cellules d'E. Coli. Approches pour résoudre le problème du diabète sucré. Contribution de la biotechnologie à la production industrielle d'hormones non peptidiques.

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MINISTERE DE L'EDUCATION ET DE LA SCIENCE DE LA REPUBLIQUE DU KAZAKHSTAN

UNIVERSITE AGROTECHNIQUE DE KAZAKH NOMME APRES S. SEYFULLIN

Département de Microbiologie et Biotechnologie

Selon la discipline "Biotechnologie des organismes humides"

Sur le sujet: Technologie d'obtention d'insuline

Terminé: Myrzabek M? Ddir Kurbanbeck?

Vérifié: AK Akimbaev (candidat à la biologie)

ABRÉVIATIONS ET SYMBOLES

1. Histoire de la découverte

2. Obtenir de l'insuline en biotechnologie

3. Méthodes d'obtention d'insuline humaine

4. Expression de la proinsuline dans les cellules E. coli

5. Nettoyage de l'insuline

6. Mode d'administration et dose

Dans ce cours, les définitions suivantes ont été utilisées:

Porteur de protéines - assurer le transport de la protéine de fusion dans l'espace périplasmique de la cellule ou du milieu de culture;

Le composant d'affinité est un facilitateur essentiel pour l'isolement de la protéine de fusion.

L'insuline (du latin. insula - island) - une hormone de nature peptidique, est formée dans les cellules bêta des îlots de pancréas de Langerhans.

Interleukines - un groupe de cytokines synthétisées principalement par les leucocytes (pour cette raison, la terminaison "-leukin" a été choisie).

Proinsuline - c'est le précurseur de l'insuline, synthétisé par les cellules B de l'appareil des îlots du pancréas.

Chromatogrunfiya (du grec chroma, chromatos - couleur, peinture), méthode physico-chimique de séparation et d'analyse de mélanges, basée sur la distribution de leurs composants entre deux phases: une stationnaire et une mobile (éluant) circulant dans une phase stationnaire.

Encapsulation - Un mécanisme de langage de programmation qui restreint l'accès aux composants (méthodes et propriétés) les rend privés, c'est-à-dire accessibles uniquement dans l'objet.

Protéine hybride (Eng. protéine de fusion, également une protéine composite chimérique) est une protéine obtenue en combinant deux gènes ou plus qui codaient à l'origine des protéines individuelles.

Gormonous (du grec hormao - je mets en mouvement, induit), des hormones, des substances biologiquement actives produites par les glandes endocrines ou des glandes de sécrétion interne et libérées directement dans le sang.

Sucre le diabète-un groupe de maladies endocriniennes qui se développent à la suite d'un déficit absolu ou relatif de l'hormone insuline.

Encapsulation - Un mécanisme de langage de programmation qui restreint l'accès aux composants (méthodes et propriétés) les rend privés, c'est-à-dire accessibles uniquement dans l'objet.

Somatostatine - une hormone des cellules delta des îlots de pancréas de Langerhans, ainsi qu'une des hormones de l'hypothalamus.

Analyse radio-immunitaire - une méthode pour la détermination quantitative de substances biologiquement actives (hormones, enzymes, médicaments, etc.) dans les fluides biologiques, basée sur la liaison compétitive des substances stables recherchées et marquées par des radionucléides à des systèmes de liaison spécifiques.

ABRÉVIATIONS ET SYMBOLES

HPLC - Chromatographie Liquide Haute Performance

ADNc - acide désoxyribonucléique complémentaire

La fonction principale de l'insuline - pour assurer la perméabilité des membranes cellulaires en glucose des molécules. En forme simplifiée, on peut dire que non seulement les hydrates de carbone, mais aussi des nutriments, en fin de compte clivés au glucose, qui est utilisé pour la synthèse d'autres molécules contenant du carbone, et est le seul type de centrales électriques à pile à combustible - mitochondries. Sans insuline, la perméabilité des membranes cellulaires pour le glucose tombe à 20 fois, et les cellules meurent de faim, et dissous dans l'excès de poisons de sucre dans le sang du corps.

La violation de la sécrétion d'insuline due à la destruction des cellules bêta - déficit absolu en insuline - est un élément clé de la pathogenèse du diabète sucré de type 1. La violation de l'action d'une insuline sur les tissus - insuffisance d'insuline relative - occupe une place importante dans le développement d'un diabète de 2ème type.

L'utilisation de la chromatographie d'affinité a réduit de manière significative la teneur en protéines contaminantes de la préparation avec un lm plus élevé que l'insuline. De telles protéines comprennent la proinsuline et la proinsuline partiellement clivée, qui sont capables d'induire la production d'anticorps anti-insuline.

L'utilisation d'insuline humaine dès le début du traitement minimise l'apparition de réactions allergiques. L'insuline humaine est absorbée plus rapidement et quelle que soit la forme du médicament, sa durée d'action est plus courte que celle de l'insuline animale. L'insuline humaine est moins immunogène que le porc, en particulier l'insuline mixte bovine et porcine.

Le but de ce cours est d'étudier la technologie d'obtention de l'insuline. Pour accomplir les tâches suivantes ont été définies:

1. Préparation de l'insuline en biotechnologie

2. Méthodes d'obtention de l'insuline

H. purification de l'insuline

L'histoire de la découverte de l'insuline est associée au nom du médecin russe IM. Sobolev (seconde moitié du 19ème siècle), qui a prouvé que le niveau de sucre dans le sang d'une personne est régulé par une hormone spéciale du pancréas.

En 1922, l’insuline, isolée du pancréas d’un animal, a été introduite pour la première fois chez un garçon de dix ans, un patient diabétique. Le résultat a dépassé toutes les attentes et un an plus tard, la société américaine «Eli Lilly» publié la première préparation d'insuline animale.

Après avoir reçu le premier lot industriel d'insuline dans les années suivantes, un long chemin de son isolement et de sa purification a été franchi. En conséquence, l'hormone est devenue disponible pour les patients atteints de diabète sucré de type 1.

En 1935, le chercheur danois Hagedorn optimise l'action de l'insuline dans le corps, offrant un médicament prolongé.

Les premiers cristaux d'insuline ont été obtenus en 1952 et en 1945, le biochimiste anglais G. Sanger a déchiffré la structure de l'insuline. Le développement de méthodes de purification de l'hormone à partir d'autres substances hormonales et de produits de dégradation de l'insuline a permis d'obtenir une insuline homogène appelée insuline monocomposante.

Au début des années 70. Les scientifiques soviétiques A. Yudaev et S. Shvachkin ont proposé une synthèse chimique de l'insuline, mais la mise en œuvre de cette synthèse à l'échelle industrielle était coûteuse et peu rentable.

À l’avenir, le degré de purification des insulines s’est amélioré, ce qui a réduit les problèmes causés par l’allergie à l’insuline, l’insuffisance rénale, la déficience visuelle et la résistance immunitaire à l’insuline. Il s'agissait de l'hormone la plus efficace pour le traitement substitutif du diabète sucré - l'insuline homologue, c'est-à-dire l'insuline humaine.

Dans les années 1980, les réalisations en biologie moléculaire ont été synthétisées à l'aide de E. coli les deux chaînes d'insuline humaine qui ont ensuite été combinées en une molécule d'hormone biologiquement active, et l'Institut de chimie bioorganique de l'Académie des sciences de Russie ont obtenu de l'insuline recombinante en utilisant des souches génétiquement modifiées E. coli.

2. Obtenir de l'insuline en biotechnologie

L'insuline, une hormone peptidique des îlots de Langerhans du pancréas, est le principal traitement du diabète sucré. Cette maladie est causée par une carence en insuline et se manifeste par une augmentation de la glycémie. Jusqu'à récemment, l'insuline était obtenue à partir du pancréas d'un taureau et d'un cochon. Le médicament différait de l'insuline humaine par 1 à 3 substitutions d'acides aminés, de sorte qu'une menace de réactions allergiques, en particulier chez les enfants, se présentait. L’usage thérapeutique à grande échelle de l’insuline était limité par son coût élevé et ses ressources limitées. Par modification chimique, l'insuline animale a été rendue impossible à distinguer de l'homme, mais cela a entraîné une augmentation supplémentaire du coût du produit. [1]

L'entreprise Eli Lilly depuis 1982, produit de l'insuline génétiquement modifiée sur la base d'une synthèse séparée E. colieChaînes A et B Le coût du produit a diminué de manière significative, l'insuline obtenue est identique à l'homme. Depuis 1980, la presse a publié des articles sur le clonage du gène de la proinsuline, précurseur de l'hormone, qui se transforme en une forme mature avec une protéolyse limitée.

Pour le traitement du diabète, une technologie d'encapsulation est également appliquée: les cellules pancréatiques de la capsule, injectées une fois dans le corps du patient, produisent de l'insuline au cours de l'année.

L'entreprise Intégré Génétique lancé la libération d'hormones folliculo-kulostimulantes et de gluten. Ces peptides sont composés de deux sous-unités. Au programme, la question de la synthèse industrielle des hormones oligopeptidiques du système nerveux-enképhalines, constituée de 5 résidus d’acides aminés et d’endorphines, analogues de la morphine. Avec l'utilisation rationnelle de ces peptides, soulagez la douleur, créez une bonne humeur, augmentez votre efficacité, concentrez-vous, améliorez la mémoire, réglez le sommeil et l'éveil. La synthèse de la p-endorphine par la technologie des protéines hybrides décrite ci-dessus pour une autre hormone peptidique, la somatostatine [2], est un exemple d'application réussie du génie génétique.

3. Méthodes d'obtention d'insuline humaine

Historiquement, le premier moyen d'obtenir de l'insuline à des fins thérapeutiques est d'isoler les analogues de cette hormone de sources naturelles (îlots du pancréas des bovins et des porcs). Dans les années 20 du siècle dernier, on a constaté que l'insuline bovine et porcine (qui est la plus proche de l'insuline humaine dans sa structure et sa séquence d'acides aminés) présente une activité comparable à celle de l'insuline humaine. Après cela, pendant longtemps pour le traitement des patients atteints de diabète de type I, insuline taureau ou des porcs ont été utilisés. Cependant, après un certain temps, il a été démontré que, dans certains cas, des anticorps contre l’insuline bovine et porcine commençaient à s’accumuler dans le corps humain, annulant ainsi leur effet.

Par ailleurs, l'un des avantages de cette méthode d'obtention de l'insuline est la disponibilité des matières premières (l'insuline bovine et porcine peut être facilement obtenue en grande quantité), ce qui a joué un rôle décisif dans le développement de la première méthode. Cette méthode était appelée semi-synthétique [3].

Avec cette méthode d'obtention d'insuline humaine, l'insuline de porc a été utilisée comme matière première. À partir de l'insuline de porc purifiée, l'octapeptide C-terminal de la chaîne B a été clivé, après quoi l'octapeptide C-terminal de l'insuline humaine a été synthétisé. Ensuite, il a été attaché chimiquement, les groupes protecteurs ont été éliminés et l'insuline obtenue a été purifiée. Lors de l'essai de cette méthode d'obtention de l'insuline, l'identité complète de l'hormone obtenue par rapport à l'insuline humaine a été mise en évidence. Le principal inconvénient de cette méthode est le coût élevé de l'insuline obtenue (même maintenant, la synthèse chimique de l'octapeptide est un plaisir coûteux, surtout à l'échelle industrielle).

À l'heure actuelle, l'insuline humaine est principalement obtenue de deux manières: par modification de l'insuline porcine par une méthode enzymatique synthétique et par génie génétique.

Dans le premier cas, la méthode repose sur le fait que l'insuline porcine diffère de l'insuline humaine par une substitution à l'extrémité C-terminale de la chaîne B Ala30Thr. Alanine en remplacement de la thréonine est effectuée par clivage catalysée par une enzyme et reliant -alanine au lieu du résidu thréonine en groupe carboxyle protégé présent dans le mélange réactionnel dans un grand excès. Après clivage du groupe O-t-butyle protecteur, l'insuline humaine est obtenue. (Figure 1)

Figure 1 - Schéma de méthodes pour obtenir de l'insuline humaine

L'insuline était la première protéine obtenue à des fins commerciales en utilisant la technologie de l'ADN recombinant. Il existe deux approches principales pour obtenir de l'insuline humaine génétiquement modifiée. Dans le premier cas, la séparation est effectuée (divers souche productrice) la préparation des deux brins, suivi par le pliage de la molécule (la formation de ponts disulfure) et la séparation mizoform. Dans un second - l'obtention d'un précurseur (pro-insuline), suivie par une digestion enzymatique avec de la trypsine et la carboxypeptidase. B à la forme active de l'hormone. On préfère à l'heure actuelle consiste à fournir de l'insuline en tant que précurseur fournissant la fermeture correcte des ponts disulfure (dans le cas des chaînes de réception distincte exploitée cycles successifs de dénaturation, renaturation et séparation mizoform [3].

Dans les deux approches, il est possible d'obtenir individuellement les composants initiaux (chaînes A et B ou proinsuline) et en tant que partie des protéines de fusion. En plus des chaînes A et B ou de la proinsuline, les protéines de fusion peuvent comprendre:

1) protéine porteuse - transport de la protéine hybride dans l'espace périplasmique de la cellule ou du milieu de culture;

2) composant d'affinité - facilitant sensiblement l'isolement de la protéine de fusion.

Ces deux composants peuvent être simultanément présents dans la composition de la protéine de fusion. En outre, lors de la création des protéines hybrides peuvent être utilisés principe multimère (par exemple, dans la protéine hybride est présente de multiples copies du polypeptide cible) peut augmenter de manière significative le rendement du produit souhaité [4].

Une souche JM 109 N1864 avec une séquence nucléotidique incorporée dans le plasmide qui exprime une protéine de fusion qui consiste en une proinsuline linéaire et un fragment de protéine attaché à son extrémité N-terminale via un résidu méthionine UnStaphylococcusaureus. La culture de la biomasse saturée de cellules de la souche recombinante fournit le début de la production d'une protéine hybride, dont l'isolement et la transformation séquentielle intube conduire à l'insuline. Un autre groupe a reçu dans un système d'expression bactérien, une protéine de fusion recombinante composée de la proinsuline humaine et relié à celui-ci par l'intermédiaire résidu methionine polyhistidine « queue ». Son isolé en utilisant une Chromatographie sur une colonne de chelation de Ni-agarose à partir de corps d'inclusion et digéré avec du bromure de cyanogène. Les auteurs ont déterminé que la protéine isolée est sulfurée en S. La cartographie et l'analyse par spectrométrie de masse de la proinsuline résultant a été purifié par Chromatographie par échange d'ions sur l'échangeur d'anions et RP (phase inverse) HPLC (Chromatographie liquide à haute performance) ont montré la présence de ponts disulfure, ce qui correspond des ponts disulfure de la proinsuline humaine native. Il a également présenté un rapport sur le développement de la nouvelle méthode et l'amélioration de la production d'insuline humaine par génie génétique dans des cellules procaryotes. Les auteurs ont constaté que l'insuline résultant de la structure et l'activité biologique identique hormone isolé du pancréas [5].

Récemment, une attention particulière a été portée à la simplification de la procédure d'obtention de l'insuline recombinante par des méthodes de génie génétique. Ainsi, une protéine de fusion constituée d'un peptide leader de l'interleukine attachée à l'extrémité N-terminale de la proinsuline a été obtenue via un résidu lysine. La protéine était efficacement exprimée et localisée dans les corps d'inclusion. Après isolement, la protéine a été coupée avec de la trypsine pour produire de l'insuline et un peptide C. Un autre groupe de chercheurs a agi de manière similaire. Une protéine de fusion constituée de proinsuline et de deux domaines synthétiques de la protéine A des staphylocoques, se liant IgG, localisée dans les corps d'inclusion, mais possédait un niveau d'expression plus élevé. La protéine a été isolée par chromatographie d'affinité en utilisant IgG et traité avec de la trypsine et de la carboxypeptidase B. L'insuline et le peptide C obtenus ont été purifiés par RP HPLC. Lors de la création de structures de fusion, le rapport de la masse protéique de support et du polypeptide cible est très important. Ainsi, la conception des structures de fusion est décrite, où une protéine de liaison à la sérum-albumine humaine est utilisée comme polypeptide porteur. Un, trois et sept C-peptides y ont été ajoutés. Les peptides C ont été reliés par le principe "tête-queue" à l'aide de séparateurs d'acides aminés portant un site de restriction. Sfi I et deux résidus d'arginine au début et à la fin de l'espaceur pour la digestion ultérieure de la protéine trypsine. Les produits de clivage par CLHP ont montré que le clivage du peptide C est quantifié, ce qui permet d'utiliser un procédé de gènes synthétiques multimères pour produire des polypeptides ciblés à l'échelle industrielle.

Produire une proinsuline mutante contenant un substitut Arg32Tyr. Lorsque la protéine a été digérée avec de la trypsine et de la carboxypeptidase B, une insuline native et un peptide C contenant un résidu de tyrosine ont été formés. Ce dernier, après marquage au 125I, est activement utilisé en radioimmunodosage [6].

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