De quoi produire de l'insuline

L'insuline est le principal médicament pour traiter le diabète sucré de type 1. Parfois, il est également utilisé pour stabiliser l'état du patient et améliorer son état de santé dans le second type de maladie. Cette substance, par sa nature, est une hormone capable à de faibles doses d’influencer le métabolisme des glucides. Normalement, le pancréas produit suffisamment d'insuline, ce qui aide à maintenir le taux physiologique de sucre dans le sang. Mais avec des troubles endocriniens graves, les injections d'insuline deviennent souvent la seule chance d'aider un patient. Le prendre oralement (sous forme de comprimés), malheureusement, est impossible, car il s'effondre complètement dans le tube digestif et perd sa valeur biologique.

Variantes de l'obtention d'insuline pour la pratique médicale

Beaucoup de diabétiques, à coup sûr, ont déjà posé une question, à partir de quoi l'insuline appliquée à des fins médicales? Actuellement, le plus souvent, ce médicament est obtenu à l'aide de méthodes de génie génétique et de biotechnologie, mais parfois il est extrait de matières premières d'origine animale.

Préparations obtenues à partir de matières premières d'origine animale

Obtenir cette hormone du pancréas des porcs et des bovins est une technologie ancienne qui est utilisée très rarement aujourd'hui. Cela est dû à la faible qualité du médicament, à sa tendance à provoquer des réactions allergiques et à un degré de purification insuffisant. Le fait est qu'une hormone étant une substance protéique, elle consiste en un ensemble spécifique d'acides aminés.

Au début et au milieu du 20ème siècle, quand il n'y avait pas de médicaments similaires, même une telle insuline était une avancée en médecine et permettait de porter le traitement des diabétiques à un nouveau niveau. Les hormones obtenues par cette méthode réduisent le taux de sucre dans le sang, mais elles provoquent souvent des effets secondaires et des allergies. Les différences dans la composition des acides aminés et des impuretés dans le médicament affectent l'état des patients, en particulier dans les catégories de patients les plus vulnérables (enfants et personnes âgées). Une autre raison de la mauvaise tolérance de cette insuline est la présence de son précurseur inactif dans le médicament (la proinsuline), dont il était impossible de se débarrasser dans cette variation du médicament.

À notre époque, il existe des insulines de porc améliorées qui ne présentent pas ces inconvénients. Ils sont obtenus à partir du pancréas du porc, mais après cela, ils reçoivent un traitement et une purification supplémentaires. Ils sont multi-composants et contiennent des substances auxiliaires.

Ces médicaments sont bien tolérés par les patients et ne provoquent pas d'effets indésirables, ils ne suppriment pas l'immunité et réduisent efficacement le taux de sucre dans le sang. L'insuline bovine n'est pas utilisée en médecine aujourd'hui, car en raison de sa structure étrangère, elle affecte négativement les systèmes immunitaires et autres du corps humain.

Insuline génétiquement modifiée

L'insuline humaine, utilisée chez les diabétiques, à l'échelle industrielle est obtenue de deux manières:

• par traitement enzymatique de l'insuline porcine;
• en utilisant des souches d'Escherichia coli ou de levure génétiquement modifiées.

Lorsque des modifications physico-chimiques de la molécule d'insuline porcine sous l'action d'enzymes spéciales deviennent identiques à l'insuline humaine. La composition en acides aminés de la préparation obtenue ne diffère pas de la composition de l'hormone naturelle produite chez l'homme. Dans le processus de production, le médicament est hautement purifié, il ne provoque donc pas de réactions allergiques et d'autres manifestations indésirables.

Mais le plus souvent, l'insuline est obtenue à l'aide de microorganismes modifiés (génétiquement modifiés). Les bactéries ou les levures à l'aide de méthodes biotechnologiques sont modifiées de telle manière qu'elles peuvent produire elles-mêmes de l'insuline.

Il existe 2 méthodes pour obtenir de l'insuline comme celle-ci. Le premier d'entre eux repose sur l'utilisation de deux souches différentes (espèces) d'un seul microorganisme. Chacune d'elles ne synthétise qu'une seule chaîne de la molécule d'ADN de l'hormone (il n'y en a que deux et elles sont torsadées en spirale). Ensuite, ces chaînes sont connectées et dans la solution résultante, il est déjà possible de séparer les formes actives de l'insuline de celles qui ne portent aucune signification biologique.

La deuxième façon d'obtenir le médicament avec E. coli ou la levure est basée sur le fait que le microbe produit d'abord de l'insuline inactive (c'est-à-dire son précurseur, la proinsuline). Ensuite, à l'aide du traitement enzymatique, cette forme est activée et utilisée en médecine.

Tous ces processus sont généralement automatisés, l'air et toutes les surfaces de contact avec les ampoules et les flacons sont stériles et les conduites avec l'équipement sont hermétiquement fermées.

Les méthodes de la biotechnologie permettent aux scientifiques de réfléchir à des solutions alternatives au problème du diabète sucré. Par exemple, à ce jour, des études précliniques sur la production de cellules bêta artificielles du pancréas, qui peuvent être obtenues par des techniques de génie génétique, sont menées. Peut-être qu'à l'avenir, ils seront utilisés pour améliorer le fonctionnement de ce corps chez une personne malade.

Composants supplémentaires

La production d'insuline sans substances auxiliaires dans le monde moderne est presque impossible à imaginer, car elle permet d'améliorer ses propriétés chimiques, de prolonger le temps d'action et d'atteindre un degré élevé de pureté.

Par ses propriétés, tous les ingrédients supplémentaires peuvent être répartis dans les classes suivantes:

• Prolongateurs (substances utilisées pour assurer une plus longue durée du médicament);
• composants désinfectants;
• stabilisants, grâce à quoi une acidité optimale est maintenue dans la solution médicamenteuse.

Prolongateurs Additifs

Il y a l'insuline à action prolongée dont l'activité biologique dure de 8 à 42 heures (selon le groupe de médicament). Cet effet est obtenu en ajoutant à la solution injectable des substances spéciales - des prolongateurs. Le plus souvent, l'un de ces composés est utilisé à cette fin:

Les protéines qui prolongent l'action du médicament subissent une purification détaillée et sont peu allergènes (par exemple, la protamine). Les sels de zinc n'ont pas non plus d'effet négatif sur l'activité de l'insuline ou sur le bien-être de la personne.

Ingrédients antimicrobiens

Les désinfectants dans la composition de l'insuline sont nécessaires pour que, pendant le stockage et l'utilisation, ils ne multiplient pas la flore microbienne. Ces substances sont des conservateurs et assurent la sécurité de l'activité biologique du médicament. De plus, si un patient entre une hormone d'un flacon à lui seul, le médicament peut lui suffire pour quelques jours. En raison de la qualité des composants antibactériens, il n'aura pas à jeter le produit inutilisé en raison de la possibilité théorique de reproduction dans une solution de microbes.

En tant que désinfectant dans la production d'insuline, ces substances peuvent être utilisées:

Pour la production de chaque type d'insuline, certains désinfectants conviennent. Leur interaction avec l’hormone est nécessairement étudiée au stade des essais précliniques, car le conservateur ne doit pas briser l’activité biologique de l’insuline ou affecter d’une manière ou d’une autre ses propriétés.

L'utilisation de conservateurs dans la plupart des cas vous permet d'injecter l'hormone sous la peau sans son traitement préliminaire avec de l'alcool ou d'autres antiseptiques (le fabricant mentionne généralement cela dans le manuel). Cela simplifie l'administration du médicament et réduit le nombre de manipulations préparatoires avant l'injection proprement dite. Mais cette recommandation ne fonctionne que si la solution est injectée avec une seringue à insuline individuelle avec une aiguille fine.

Stabilisants

Les stabilisants sont nécessaires pour garantir que le pH de la solution est maintenu à un niveau prédéterminé. Le niveau d'acidité dépend de la sécurité du médicament, de son activité et de la stabilité de ses propriétés chimiques. Pour la production d'une hormone injectable pour les diabétiques, les phosphates sont généralement utilisés à cette fin.

Pour les insulines contenant du zinc, les stabilisants en solution ne sont pas toujours nécessaires, car les ions métalliques aident à maintenir l'équilibre nécessaire. Si elles sont encore appliquées, d'autres composés chimiques sont utilisés à la place des phosphates, car une combinaison de ces substances entraîne des précipitations et l'inaptitude du médicament. Une des propriétés importantes de tous les stabilisants est la sécurité et l’impossibilité de réagir à l’insuline.

Le choix d'injecter des médicaments pour le diabète pour chaque patient doit être effectué par un endocrinologue compétent. La tâche de l’insuline n’est pas seulement de maintenir une glycémie normale, mais aussi de ne pas nuire à d’autres organes et systèmes. Le médicament doit être chimiquement neutre, peu allergène et de préférence abordable. Il est également très pratique que l'insuline sélectionnée puisse être mélangée avec ses autres versions à la durée de l'action.

L'insuline

L'introduction de l'insuline est considérée comme le moyen le plus efficace de normaliser le taux de glucose dans le sang humain. L'hormone synthétisée artificiellement aide à faire face à des quantités excessives de sucre dans le corps.

Les types d'insuline se distinguent par la durée de l'action, l'origine et le principe d'action sur le corps.

La durée d'exposition au corps distingue:

1. Une insuline courte est injectée avant les repas, par voie sous-cutanée ou intramusculaire, et commence son action après 15 minutes. La durée d'action est de 6 à 8 heures, en fonction de la dose administrée.
2. L'insuline de durée moyenne commence à affecter l'organisme 1 à 3 heures après avoir mangé. La période d'exposition est de 10-24 heures.
3. Une exposition prolongée à l'insuline agit sur le corps assez longtemps. Le patient entre la dose une ou deux fois par jour. L'hormone commence quatre heures après l'injection.
4. L'insuline de la période ultracourte est introduite dans le corps pendant les repas et commence à affecter 15 minutes après l'injection.

Avec l'insulinothérapie, vous devez suivre un schéma spécifique d'administration d'hormones, en vous concentrant sur la période d'action.

Par origine, l'insuline se produit:

1. Une hormone animale d'un gros chat à cornes - provoque souvent des réactions allergiques en raison d'une différence marquée par rapport à une hormone humaine.
2. L'hormone porcine est plus identique à l'insuline humaine et est le plus souvent utilisée en médecine.
3. La simulation de l'insuline humaine se fait à l'aide d'E. Coli ou est synthétisée à partir de l'hormone porcine. Dans ce cas, l'allergène est dérivé de l'hormone.

Par le degré de purification qu'ils distinguent:

• L'insuline traditionnelle, qui provoque souvent des réactions allergiques dues à l'utilisation de méthodes de nettoyage imparfaites.
• L'insuline monopique est purifiée à l'aide de filtres spéciaux qui réduisent la quantité d'impuretés dans l'hormone.
• L'insuline monocomposant est considérée comme la plus efficace et se caractérise par une purification presque complète de l'hormone des impuretés.

Malgré le degré de purification, il est important d'utiliser une hormone d'un fabricant afin d'éviter les réactions allergiques.

Lors du choix du type d'insuline, le patient doit être guidé par son âge, son mode de vie et ses habitudes personnelles. Le patient doit tenir compte de la fréquence à laquelle il envisage de s'injecter, de la possibilité de mesurer régulièrement le taux de sucre dans l'organisme, des charges physiques standard sur le corps. En outre, l'insuline est choisie en fonction de la réponse de l'organisme à l'hormone, de la rapidité avec laquelle le médicament est absorbé et du pic d'activité.

Types d'insuline

Les préparations d'insuline diffèrent les unes des autres par le degré de purification; source de réception (bovin, porc, humain); substances ajoutées à la solution d'insuline (allongement de son action, bactériostatique, etc.); concentration; la valeur du pH; la possibilité de mélanger avec la CIM SDI.

Les préparations d'insuline diffèrent selon la source de préparation. L'insuline d'un porc et d'un taureau diffère d'un humain par sa composition en acides aminés: bovin - trois acides aminés et un porc - un par un. Il n’est pas surprenant qu’avec le traitement de l’insuline bovine, les effets indésirables se développent beaucoup plus souvent que lorsqu’ils sont traités avec de l’insuline porcine ou humaine. Ces réactions sont exprimées en résistance à l'insuline immunologique, allergie à l'insuline, lipodystrophies (changement de graisse sous-cutanée au site d'injection).

Malgré les lacunes évidentes de l'insuline bovine, il est encore largement utilisé dans le monde. Cependant, les lacunes de l'insuline bovine en termes immunologiques sont évidents: il est en aucun cas le cas n'est pas recommandé pour les patients nouvellement diagnostiqués avec le diabète, les femmes enceintes ou pour un traitement à l'insuline à court terme, par exemple dans la période périopératoire. qualités négatives sont conservées l'insuline bovine et lorsqu'il est utilisé en mélange avec du porc, mais mélangés (porc + bovine) insulines pas être utilisé pour le traitement de ces catégories de patients.

Les préparations d'insuline humaine par structure chimique sont complètement identiques à l'insuline humaine.

Le principal problème de la méthode biosynthétique d'obtention de l'insuline humaine est la purification complète du produit final à partir des moindres impuretés des microorganismes utilisés et des produits de leur activité vitale. De nouvelles méthodes de contrôle de la qualité garantissent que l'insuline humaine biosynthétique des fabricants susmentionnés est exempte d'impuretés nocives. ainsi, leur degré de purification et leur efficacité hypoglycémique répondent aux exigences les plus élevées et sont pratiquement identiques. Tous les effets secondaires indésirables, en fonction des impuretés, ces médicaments ne contiennent pas d'insuline.

Actuellement, dans la pratique médicale, utiliser l'insuline de trois types:

- agissant rapidement avec un effet rapide de l'effet;

- durée moyenne de l'action;

- longue action avec une manifestation lente de l'effet.

Tableau 1. Caractéristiques des préparations d'insuline commerciales

Exemples (noms commerciaux)

Methylparaben m-Cresol Phenol

NaCl Glycérine Na (H) PO4 Na acétate

Humain Taureau

Actrapid-NM, Humulin-R Actrapid, Actrapid-MS Insuline pour injection (URSS, plus produit)

Humain Taureau

Protafan-NM, Protuline de Protafan-MS Humulin-N (URSS, plus produite)

Humain Taureau

Monotard-NM, Monotard Humulin-zinc-MS, Lente-MS Lente

insuline à action rapide (CIM) - insuline ordinaire - est un court-soluble à un pH neutre, de l'insuline de zinc cristallin, dont l'effet se développe dans les 15 minutes après l'administration sous-cutanée et dure 5-7 heures.

La première insuline à action prolongée (IAP) a été créé dans les années 30 en retard que les patients ont pu injecter moins fréquemment qu'il utilisait seulement la CIM -. Dans la mesure du possible, une fois par jour. Afin d'augmenter la durée d'action de toutes les autres drogues et de l'insuline modifiés par dissolution dans un milieu neutre pour former une suspension. Ils contiennent protamine dans un tampon de phosphate - insuline de zinc protamine et NPH (de protamine neutre Hagedorn) - NPH-insuline et de diverses concentrations de zinc dans un tampon acétate - ultralente insulines, bande, semilente.

Les préparations d'insuline de durée moyenne d'action contiennent de la protamine, une protéine de poids moléculaire moyen. 4400, riche en arginine et dérivé du lait de truite arc-en-ciel. Pour former un complexe, le rapport de la protamine à l'insuline est de 1:10. après administration sous-cutanée, les enzymes protéolytiques détruisent la protamine, ce qui permet d'absorber l'insuline.

La NPH-insuline ne modifie pas le profil pharmacocinétique de l'insuline régulatrice mélangée à celle-ci. La NPH-insuline est préférable à la bande d'insuline en tant que composant de la durée d'action moyenne dans les mélanges thérapeutiques contenant de l'insuline ordinaire.

Dans un tampon phosphate, toutes les insulines forment facilement des cristaux avec du zinc, mais seuls les cristaux d'insuline bovine ont une hydrophobie suffisante pour permettre une libération soutenue et stable de l'insuline caractéristique de l'ultra-bande. Les cristaux de zinc de l'insuline porcine se dissolvent plus rapidement, l'effet se produit plus tôt, la durée d'action est plus courte. Par conséquent, il n'existe pas de médicament ultra-puissant contenant uniquement de l'insuline porcine. L'insuline monocomposant de porc est fabriquée sous le nom d'insuline-suspension, d'insuline-neutre, d'insuline-isophane, d'insuline-aminoquinuride.

Ruban insuline - un mélange de 30% d'insuline semilente (précipité amorphe d'ions d'insuline de zinc en effet tampon acétate qui dissipe relativement rapidement) avec 70% d'insuline ultralente (peu solubles, zinc cristallin insuline ayant une apparition lente et une action prolongée). Ces deux composants offrent une combinaison d'une absorption relativement rapide de l'stable et à long agent thérapeutique durable, ce qui rend pratique la bande d'insuline.

Types d'insuline et méthodes pour l'obtenir

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Résumé sur la discipline Médecine sur le thème: Types d'insuline et méthodes de production; concept et types, classification et structure, 2016-2017, 2018.

• INTRODUCTION
• 1. Types d'insuline
• 2. Obtenir de l'insuline
• Conclusion
• Références
• INTRODUCTION
• Insulim (du latin insula - island) - une hormone de nature peptidique, se forme dans les cellules bêta des îlots de pancréas de Langerhans. A une influence multiple sur l'échange dans presque tous les tissus.
• La fonction principale de l'insuline - pour assurer la perméabilité des membranes cellulaires en glucose des molécules. En forme simplifiée, on peut dire que non seulement les hydrates de carbone, mais aussi des nutriments finalement clivés au glucose, qui est utilisé pour la synthèse d'autres molécules contenant du carbone, et est le seul type de centrales électriques à pile à combustible - mitochondries. Sans insuline, la perméabilité des membranes cellulaires pour le glucose tombe à 20 fois, et les cellules meurent de faim, et dissous dans l'excès de poisons de sucre dans le sang du corps.
• La violation de la sécrétion d'insuline due à la destruction des cellules bêta - déficit absolu en insuline - est un élément clé de la pathogenèse du diabète sucré de type 1. La violation de l'action d'une insuline sur les tissus - insuffisance d'insuline relative - occupe une place importante dans le développement d'un diabète de 2ème type.
• L'histoire de la découverte de l'insuline est associée au nom du médecin russe IM. Sobolev (seconde moitié du 19ème siècle), qui a prouvé que le niveau de sucre dans le sang d'une personne est régulé par une hormone spéciale du pancréas.
• En 1922, l'insuline, isolée du pancréas d'un animal, a été introduite chez un garçon de dix ans, diabétique. le résultat a dépassé toutes les attentes et un an plus tard, la firme américaine "Eli Lilly" a publié la première préparation d'insuline animale.
• Après avoir reçu le premier lot industriel d'insuline dans les années suivantes, un long chemin de son isolement et de sa purification a été franchi. En conséquence, l'hormone est devenue disponible pour les patients atteints de diabète sucré de type 1.
• En 1935, le chercheur danois Hagedorn optimise l'action de l'insuline dans le corps, offrant un médicament prolongé.
• Les premiers cristaux d'insuline ont été obtenus en 1952 et, en 1945, le biochimiste anglais G. Sanger a déchiffré la structure de l'insuline. La mise au point de méthodes de purification de l'hormone à partir d'autres substances hormonales et de produits de dégradation de l'insuline a permis d'obtenir une insuline homogène appelée insuline à un composant.
• Au début des années 70. Les scientifiques soviétiques A. Yudaev et S. Shvachkin ont proposé une synthèse chimique de l'insuline, mais la mise en œuvre de cette synthèse à l'échelle industrielle était coûteuse et peu rentable.
• À l’avenir, le degré de purification des insulines s’est amélioré, ce qui a réduit les problèmes causés par l’allergie à l’insuline, l’insuffisance rénale, la déficience visuelle et la résistance immunitaire à l’insuline. Il s'agissait de l'hormone la plus efficace pour le traitement substitutif du diabète sucré - l'insuline homologue, c'est-à-dire l'insuline humaine.
• En 80 années, des progrès en biologie moléculaire ont permis synthétisé en utilisant E. coli les deux chaînes de l'insuline humaine, qui ont été ensuite relié à une molécule biologiquement active, une hormone, et l'Institute of Bioorganic Chemistry insuline recombinante préparée en utilisant souches de E. coli génétiquement modifiées.
• L'utilisation de la chromotographie par affinité a permis de réduire de manière significative la teneur en protéines contaminantes de la préparation avec un lm plus élevé que l'insuline. De telles protéines comprennent la proinsuline et la proinsuline partiellement clivée, qui sont capables d'induire la production d'anticorps anti-insuline.
• L'utilisation d'insuline humaine dès le début du traitement minimise l'apparition de réactions allergiques. L'insuline humaine est absorbée plus rapidement et quelle que soit la forme du médicament, sa durée d'action est plus courte que celle de l'insuline animale. L'insuline humaine est moins immunogène que le porc, en particulier l'insuline mixte bovine et porcine.

Les préparations d'insuline diffèrent les unes des autres par le degré de purification; source de réception (bovin, porc, humain); substances ajoutées à la solution d'insuline (allongement de son action, bactériostatique, etc.); concentration; la valeur du pH; la possibilité de mélanger avec la CIM SDI.

Les préparations d'insuline diffèrent selon la source de préparation. L'insuline d'un porc et d'un taureau diffère d'un humain par sa composition en acides aminés: bovin - trois acides aminés et un porc - un par un. Il n’est pas surprenant qu’avec le traitement de l’insuline bovine, les effets indésirables se développent beaucoup plus souvent que lorsqu’ils sont traités avec de l’insuline porcine ou humaine. Ces réactions sont exprimées en résistance à l'insuline immunologique, allergie à l'insuline, lipodystrophies (changement de graisse sous-cutanée au site d'injection).

Malgré les lacunes évidentes de l'insuline bovine, il est encore largement utilisé dans le monde. Cependant, les lacunes de l'insuline bovine en termes immunologiques sont évidents: il est en aucun cas le cas n'est pas recommandé pour les patients nouvellement diagnostiqués avec le diabète, les femmes enceintes ou pour un traitement à l'insuline à court terme, par exemple dans la période périopératoire. qualités négatives sont conservées l'insuline bovine et lorsqu'il est utilisé en mélange avec du porc, mais mélangés (porc + bovine) insulines pas être utilisé pour le traitement de ces catégories de patients.

Les préparations d'insuline humaine par structure chimique sont complètement identiques à l'insuline humaine.

Le principal problème de la méthode biosynthétique d'obtention de l'insuline humaine est la purification complète du produit final à partir des moindres impuretés des microorganismes utilisés et des produits de leur activité vitale. De nouvelles méthodes de contrôle de la qualité garantissent que l'insuline humaine biosynthétique des fabricants susmentionnés est exempte d'impuretés nocives. ainsi, leur degré de purification et leur efficacité hypoglycémique répondent aux exigences les plus élevées et sont pratiquement identiques. Tous les effets secondaires indésirables, en fonction des impuretés, ces médicaments ne contiennent pas d'insuline.

Actuellement, dans la pratique médicale, utiliser l'insuline de trois types:

- agissant rapidement avec un effet rapide de l'effet;

- durée moyenne de l'action;

- longue action avec une manifestation lente de l'effet.

Tableau 1. Caractéristiques des préparations d'insuline commerciales

Types d'insuline

Contenu

1. Types d'insuline

2. Obtenir de l'insuline

L'insuline (du latin insula - island) - une hormone de nature peptidique, est formée dans les cellules bêta des îlots du pancréas de Langerhans. A une influence multiple sur l'échange dans presque tous les tissus.

La fonction principale de l'insuline est d'assurer la perméabilité des membranes cellulaires aux molécules de glucose. En forme simplifiée, on peut dire que non seulement les hydrates de carbone, mais aussi des nutriments finalement clivés au glucose, qui est utilisé pour la synthèse d'autres molécules contenant du carbone, et est le seul type de centrales électriques à pile à combustible - mitochondries. Sans insuline, la perméabilité des membranes cellulaires pour le glucose tombe à 20 fois, et les cellules meurent de faim, et dissous dans l'excès de poisons de sucre dans le sang du corps.

La violation de la sécrétion d'insuline due à la destruction des cellules bêta - déficit absolu en insuline - est un élément clé de la pathogenèse du diabète sucré de type 1. La violation de l'action d'une insuline sur les tissus - insuffisance d'insuline relative - occupe une place importante dans le développement d'un diabète de 2ème type.

L'histoire de la découverte de l'insuline est associée au nom du médecin russe IM. Sobolev (seconde moitié du 19ème siècle), qui a prouvé que le niveau de sucre dans le sang d'une personne est régulé par une hormone spéciale du pancréas.

En 1922, l'insuline, isolée du pancréas d'un animal, a été introduite chez un garçon de dix ans, diabétique. le résultat a dépassé toutes les attentes et un an plus tard, la firme américaine "Eli Lilly" a publié la première préparation d'insuline animale.

Après avoir reçu le premier lot industriel d'insuline dans les années suivantes, un long chemin de son isolement et de sa purification a été franchi. En conséquence, l'hormone est devenue disponible pour les patients atteints de diabète sucré de type 1.

En 1935, le chercheur danois Hagedorn optimise l'action de l'insuline dans le corps, offrant un médicament prolongé.

Les premiers cristaux d'insuline ont été obtenus en 1952 et, en 1945, le biochimiste anglais G. Sanger a déchiffré la structure de l'insuline. La mise au point de méthodes de purification de l'hormone à partir d'autres substances hormonales et de produits de dégradation de l'insuline a permis d'obtenir une insuline homogène appelée insuline à un composant.

Au début des années 70. Les scientifiques soviétiques A. Yudaev et S. Shvachkin ont proposé une synthèse chimique de l'insuline, mais la mise en œuvre de cette synthèse à l'échelle industrielle était coûteuse et peu rentable.

À l’avenir, le degré de purification des insulines s’est amélioré, ce qui a réduit les problèmes causés par l’allergie à l’insuline, l’insuffisance rénale, la déficience visuelle et la résistance immunitaire à l’insuline. Il s'agissait de l'hormone la plus efficace pour le traitement substitutif du diabète sucré - l'insuline homologue, c'est-à-dire l'insuline humaine.

En 80 années, des progrès en biologie moléculaire ont permis synthétisé en utilisant E. coli les deux chaînes de l'insuline humaine, qui ont été ensuite relié à une molécule biologiquement active, une hormone, et l'Institute of Bioorganic Chemistry insuline recombinante préparée en utilisant souches de E. coli génétiquement modifiées.

L'utilisation de la chromotographie par affinité a permis de réduire de manière significative la teneur en protéines contaminantes de la préparation avec un lm plus élevé que l'insuline. De telles protéines comprennent la proinsuline et la proinsuline partiellement clivée, qui sont capables d'induire la production d'anticorps anti-insuline.

L'utilisation d'insuline humaine dès le début du traitement minimise l'apparition de réactions allergiques. L'insuline humaine est absorbée plus rapidement et quelle que soit la forme du médicament, sa durée d'action est plus courte que celle de l'insuline animale. L'insuline humaine est moins immunogène que le porc, en particulier l'insuline mixte bovine et porcine.

1. Types d'insuline

Les préparations d'insuline diffèrent les unes des autres par le degré de purification; source de réception (bovin, porc, humain); substances ajoutées à la solution d'insuline (allongement de son action, bactériostatique, etc.); concentration; la valeur du pH; la possibilité de mélanger avec la CIM SDI.

Les préparations d'insuline diffèrent selon la source de préparation. L'insuline d'un porc et d'un taureau diffère d'un humain par sa composition en acides aminés: bovin - trois acides aminés et un porc - un par un. Il n’est pas surprenant qu’avec le traitement de l’insuline bovine, les effets indésirables se développent beaucoup plus souvent que lorsqu’ils sont traités avec de l’insuline porcine ou humaine. Ces réactions sont exprimées en résistance à l'insuline immunologique, allergie à l'insuline, lipodystrophies (changement de graisse sous-cutanée au site d'injection).

Malgré les lacunes évidentes de l'insuline bovine, il est encore largement utilisé dans le monde. Cependant, les lacunes de l'insuline bovine en termes immunologiques sont évidents: il est en aucun cas le cas n'est pas recommandé pour les patients nouvellement diagnostiqués avec le diabète, les femmes enceintes ou pour un traitement à l'insuline à court terme, par exemple dans la période périopératoire. qualités négatives sont conservées l'insuline bovine et lorsqu'il est utilisé en mélange avec du porc, mais mélangés (porc + bovine) insulines pas être utilisé pour le traitement de ces catégories de patients.

Les préparations d'insuline humaine par structure chimique sont complètement identiques à l'insuline humaine.

Le principal problème de la méthode biosynthétique d'obtention de l'insuline humaine est la purification complète du produit final à partir des moindres impuretés des microorganismes utilisés et des produits de leur activité vitale. De nouvelles méthodes de contrôle de la qualité garantissent que l'insuline humaine biosynthétique des fabricants susmentionnés est exempte d'impuretés nocives. ainsi, leur degré de purification et leur efficacité hypoglycémique répondent aux exigences les plus élevées et sont pratiquement identiques. Tous les effets secondaires indésirables, en fonction des impuretés, ces médicaments ne contiennent pas d'insuline.

Actuellement, dans la pratique médicale, utiliser l'insuline de trois types:

- agissant rapidement avec un effet rapide de l'effet;

- durée moyenne de l'action;

- longue action avec une manifestation lente de l'effet.

Tableau 1. Caractéristiques des préparations d'insuline commerciales

Exemples (noms commerciaux)

Methylparaben m-Cresol Phenol

NaCl Glycérine Na (H) PO4 Na acétate

Humain Taureau

Actrapid-NM, Humulin-R Actrapid, Actrapid-MS Insuline pour injection (URSS, plus produit)

Humain Taureau

Protafan-NM, Protuline de Protafan-MS Humulin-N (URSS, plus produite)

Humain Taureau

Monotard-NM, Monotard Humulin-zinc-MS, Lente-MS Lente

L'insuline à courte durée d'action (ICD) - insuline ordinaire - est une insuline de zinc soluble cristalline à courte durée d'action à pH neutre, dont l'effet se développe dans les 15 minutes suivant l'administration sous-cutanée et dure 5-7 heures.

La première insuline à action prolongée (IAP) a été créé dans les années 30 en retard que les patients ont pu injecter moins fréquemment qu'il utilisait seulement la CIM -. Dans la mesure du possible, une fois par jour. Afin d'augmenter la durée d'action de toutes les autres drogues et de l'insuline modifiés par dissolution dans un milieu neutre pour former une suspension. Ils contiennent protamine dans un tampon de phosphate - insuline de zinc protamine et NPH (de protamine neutre Hagedorn) - NPH-insuline et de diverses concentrations de zinc dans un tampon acétate - ultralente insulines, bande, semilente.

Les préparations d'insuline de durée moyenne d'action contiennent de la protamine, une protéine de poids moléculaire moyen. 4400, riche en arginine et dérivé du lait de truite arc-en-ciel. Pour former un complexe, le rapport de la protamine à l'insuline est de 1:10. après administration sous-cutanée, les enzymes protéolytiques détruisent la protamine, ce qui permet d'absorber l'insuline.

La NPH-insuline ne modifie pas le profil pharmacocinétique de l'insuline régulatrice mélangée à celle-ci. La NPH-insuline est préférable à la bande d'insuline en tant que composant de la durée d'action moyenne dans les mélanges thérapeutiques contenant de l'insuline ordinaire.

Dans un tampon phosphate, toutes les insulines forment facilement des cristaux avec du zinc, mais seuls les cristaux d'insuline bovine ont une hydrophobie suffisante pour permettre une libération soutenue et stable de l'insuline caractéristique de l'ultra-bande. Les cristaux de zinc de l'insuline porcine se dissolvent plus rapidement, l'effet se produit plus tôt, la durée d'action est plus courte. Par conséquent, il n'existe pas de médicament ultra-puissant contenant uniquement de l'insuline porcine. L'insuline monocomposant de porc est fabriquée sous le nom d'insuline-suspension, d'insuline-neutre, d'insuline-isophane, d'insuline-aminoquinuride.

Ruban insuline - un mélange de 30% d'insuline semilente (précipité amorphe d'ions d'insuline de zinc en effet tampon acétate qui dissipe relativement rapidement) avec 70% d'insuline ultralente (peu solubles, zinc cristallin insuline ayant une apparition lente et une action prolongée). Ces deux composants offrent une combinaison d'une absorption relativement rapide de l'stable et à long agent thérapeutique durable, ce qui rend pratique la bande d'insuline.

2. Obtenir de l'insuline

L'insuline humaine peut être produite de quatre manières:

1) synthèse chimique complète;

2) extraction du pancréas humain (ces deux méthodes ne conviennent pas en raison de leur caractère non économique: développement insuffisant de la première méthode et manque de matières premières pour la production en série de la deuxième manière);

3) méthode semi-synthétique utilisant une substitution enzyme-chimique en position 30 de la chaîne B de l'acide aminé alanine dans l'insuline porcine pour la thréonine;

4) méthode biosynthétique pour le génie génétique. Ces deux dernières méthodes permettent d'obtenir de l'insuline humaine avec un degré de purification élevé.

À l'heure actuelle, l'insuline humaine est principalement obtenue de deux manières: par modification de l'insuline porcine par une méthode enzymatique synthétique et par génie génétique.

L'insuline était la première protéine obtenue à des fins commerciales en utilisant la technologie de l'ADN recombinant. Il existe deux approches principales pour obtenir de l'insuline humaine génétiquement modifiée.

Dans le premier cas, on obtient séparément (différentes souches productrices), en obtenant les deux chaînes avec le pliage ultérieur de la molécule (formation de ponts disulfure) et la séparation des isoformes.

Dans un second - l'obtention d'un précurseur (pro-insuline), suivie par la digestion enzymatique avec la trypsine B et la carboxypeptidase pour former l'hormone active. On préfère à l'heure actuelle consiste à fournir de l'insuline en tant que précurseur fournissant la fermeture correcte des ponts disulfure (dans le cas des chaînes de réception distincte exploitée cycles successifs de dénaturation, renaturation et la séparation des isoformes).

Dans les deux approches, il est possible d'obtenir individuellement les composants initiaux (chaînes A et B ou proinsuline) et en tant que partie des protéines de fusion. En plus des chaînes A et B ou de la proinsuline, les protéines de fusion peuvent comprendre:

- un support protéique transportant la protéine hybride dans l'espace périplasmique de la cellule ou du milieu de culture;

- un composant d'affinité qui facilite de manière significative l'isolement de la protéine de fusion.

Ces deux composants peuvent être simultanément présents dans la composition de la protéine de fusion. De plus, lors de la création de protéines hybrides, le principe de multimérisation peut être utilisé (c'est-à-dire que plusieurs copies du polypeptide cible sont présentes dans la protéine hybride), ce qui permet d'augmenter sensiblement le rendement du produit cible.

Au Royaume-Uni, en utilisant E. coli, les deux chaînes d'insuline humaine ont été synthétisées, puis combinées en une molécule d'une hormone biologiquement active. Pour qu'un organisme unicellulaire synthétise des molécules d'insuline sur ses ribosomes, il faut lui fournir le programme nécessaire, c'est-à-dire introduire un gène d'hormone.

Le gène synthétisant la biosynthèse d'un précurseur d'insuline ou de deux gènes programmant séparément la biosynthèse des chaînes d'insuline A et B est obtenu chimiquement.

L'étape suivante consiste à inclure le gène précurseur de l'insuline (ou les gènes de la chaîne séparément) dans le génome d'E.coli, une souche spéciale d'E. Coli cultivée dans des conditions de laboratoire. Cette tâche est effectuée par génie génétique.

A partir de E. coli, isoler le plasmide avec l'enzyme de restriction correspondante. le gène synthétique est inséré dans le plasmide (clonage avec la partie C-terminale fonctionnellement active de la ß-galactosidase de E. coli). En conséquence, E.coli acquiert la capacité de synthétiser une chaîne protéique constituée de galactosidase et d'insuline. Les polypeptides synthétisés sont séparés de l'enzyme par des moyens chimiques, puis ils sont effectués et purifiés. Dans les bactéries, environ 100 000 molécules d'insuline sont synchronisées sur une cellule bactérienne.

Nature substance hormonale produite par E. coli, est causée par un gène incorporé dans le génome d'un organisme unicellulaire. Si le gène clone du précurseur de l'insuline, une bactérie synthétise précurseur de l'insuline qui est ensuite soumis à un traitement avec des enzymes de restriction pour cliver prepitida avec l'isolement de C-peptide, obtenant ainsi une insuline biologiquement active.

Pour l'insuline humaine purifiée dérivée de la biomasse est soumise à la protéine de fusion de Khimki transformation enzymatique et purification par chromatographie en phase correspondant (fprntalnoy, perméation sur gel, échange d'anions).

L'insuline recombinante RAS Institute préparé en utilisant des souches de E. coli génétiquement modifiées. de la biomasse cultivée est allouée protéine de fusion exprimée de précurseur en une quantité de 40% de la protéine cellulaire totale comprenant la préproinsuline. Sa conversion en vitroosuschestvlyaetsya d'insuline dans la même séquence que celle in vivo - premier polypeptide clivé, la préproinsuline est convertie en insuline par le sulfitoliza par oxydation suivie d'une fermeture réductrice trois liaisons disulfure reliant l'isolement et enzymatique C-peptide. Après plusieurs purifications chromatographiques, y compris l'échange d'ions, le gel et HPLC pour donner l'insuline humaine de haute pureté et de l'activité naturelle.

Il est possible d'utiliser une souche avec le plasmide intégré dans la séquence nucléotidique exprimant une protéine de fusion qui consiste en une proinsuline linéaire et fixé à son résidu méthionine N-terminal à travers l'extrémité de la protéine A de Staphylococcus aureus fragment.

La culture de la biomasse saturée de cellules de la souche recombinante fournit le début de la production d'une protéine de fusion, dont l'isolement et la transformation séquentielle dans le tube conduisent à l'insuline.

Une autre manière est possible: dans le système d'expression bactérien, une protéine recombinante fusionnée constituée de proinsuline humaine et d'une "queue" de polyhistidine qui lui est attachée à travers le résidu méthionine est obtenue. Il est isolé en utilisant une chromatographie sur chélate sur des colonnes de Ni-agarose provenant de corps d'inclusion et digéré avec du bromocyanate.

La protéine isolée est S-sulfonée. La cartographie et l'analyse par spectrométrie de masse de la proinsuline résultant a été purifié par Chromatographie par échange d'ions sur l'échangeur d'anions et RP (phase inverse) HPLC (Chromatographie liquide à haute performance) ont montré la présence de ponts disulfure, ce qui correspond des ponts disulfure de la proinsuline humaine native.

Récemment, une attention particulière a été portée à la simplification de la procédure d'obtention de l'insuline recombinante par des méthodes de génie génétique. Ainsi, par exemple, il est possible d'obtenir une protéine de fusion constituée d'un peptide leader de l'interleukine 2 attachée à l'extrémité N-terminale de la proinsuline, via un résidu lysine. La protéine est efficacement exprimée et localisée dans les corps d'inclusion. Après isolement, la protéine est coupée avec de la trypsine pour produire de l'insuline et un peptide C.

L'insuline résultant et C-peptide a été purifié par RP HPLC. Lors de la création de structures de fusion, le rapport de la masse protéique de support et du polypeptide cible est très important. C-peptides sont assemblés sur une « tête-bêche » avec les espaceurs d'acides aminés portant des sites de restriction Sfi I et deux résidus arginine au début et à la fin d'une entretoise pour la digestion de la trypsine ultérieure de la protéine. produit de clivage par HPLC indique que le clivage du C-peptide se déroule quantitativement, de façon à utiliser un procédé de synthèse de gènes multimères pour produire le polypeptide désiré à une échelle commerciale.

Conclusion

Le diabète sucré est une maladie chronique causée par une insuffisance absolue ou relative de l'insuline. Elle se caractérise par une perturbation profonde du métabolisme des glucides par l'hyperglycémie et la glucosurie, ainsi que par d'autres troubles métaboliques résultant de nombreux facteurs génétiques et externes.

À ce jour, l’insuline a servi de moyen radical, et dans la plupart des cas, le seul moyen de maintenir la vie et la capacité de travailler des patients diabétiques. Avant de recevoir et d'introduire de l'insuline à la clinique en 1922-1923. des patients atteints de diabète de type I attendaient une issue fatale dans un délai d'un à deux ans après l'apparition de la maladie, malgré l'utilisation des régimes les plus débilitants. Les patients atteints de diabète de type I ont besoin d'un traitement substitutif à vie avec des préparations d'insuline. La résiliation due à diverses raisons pour l'introduction régulière d'insuline conduit à un développement rapide des complications et à la mort rapide du patient.

Actuellement, le diabète sucré arrive en troisième position après les maladies cardiovasculaires et oncologiques. Selon l'Organisation mondiale de la santé, la prévalence du diabète dans la population adulte dans la plupart des régions du monde est de 2 à 5% et il y a une tendance à augmenter le nombre de patients presque deux fois tous les 15 ans. Malgré des progrès évidents dans le domaine de la santé, le nombre de patients insulino-dépendants augmente chaque année et actuellement, environ 2 millions de personnes seulement vivent en Russie.

La création de préparations d'insuline humaine génétiquement modifiée ouvre de nouvelles possibilités pour résoudre de nombreux problèmes de diabète en Russie afin de sauver la vie de millions de personnes souffrant de diabète.

1. Biotechnology: Textbook for High Schools / Ed. N.S. Egorova, V.D. Samuilova. - Moscou: école supérieure, 1987, pp. 15-25.
2. Insuline humaine génétiquement modifiée. Augmenter l'efficacité de la séparation chromatographique en utilisant le principe de la bifonctionnalité. / Romanchikov AB, Yakimov SA, Klyushnichenko VE, Arutyunyan AM, Woolfson AN // Bioorganic Chemistry, 1997 - 23, No. 2
3. Glik B., Pasternak J. Biotechnologie moléculaire. Principes et applications. Moscou: le monde, 2002.
4. Egorov NS, Samuilov VD Méthodes modernes de création de souches industrielles de micro-organismes // Biotechnologie. Livre 2. Moscou: école supérieure, 1988. 208 p.
5. Immobilisation de la trypsine et de la carboxypeptidase B sur de la silice modifiée et leur utilisation dans la conversion de la proinsuline humaine recombinante en insuline. / Kudryavtseva NE, LS Zhigis, VP Zubov, AI Woolfson, Maltsev KV, Rumsh LD // Pharmaciens-chimistes. Zh., 1995-29, n ° 1 pages 61-64.
6. Biologie moléculaire. Structure et fonctions des protéines / Stepanov V. M. // Moscou, école supérieure, 1996.
7. Principes fondamentaux de la biotechnologie pharmaceutique: Manuel / Т.П. Prischep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhalev. - Rostov-on-Don.: Phoenix; Tomsk: éditeur de NTL, 2006.
8. Synthèse de fragments d'insuline et étude de leurs propriétés physico-chimiques et immunologiques. / Panin LE, Tuzikov FV, ON Poteryaeva, Maksyutov AZ, Tuzikova NA, Sabirov AN // Bioorganic Chemistry, 1997 - 23, № 12 pages 953 - 960.

Types d'insuline et méthodes pour l'obtenir

Information - Médecine, éducation physique, santé

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Le nombre de microorganismes utilisés et les produits de leurs fonctions vitales. De nouvelles méthodes de contrôle de la qualité garantissent que l'insuline humaine biosynthétique des fabricants susmentionnés est exempte d'impuretés nocives. ainsi, leur degré de purification et leur efficacité hypoglycémique répondent aux exigences les plus élevées et sont pratiquement identiques. Tous les effets secondaires indésirables, en fonction des impuretés, ces médicaments ne contiennent pas d'insuline.

Actuellement, dans la pratique médicale, utiliser l'insuline de trois types:

- agissant rapidement avec un effet rapide de l'effet;

- durée moyenne de l'action;

- longue action avec une manifestation lente de l'effet.

Tableau 1. Caractéristiques des préparations d'insuline commerciales

Synonymes Type d'insuline d'extension tampon Preservative / sel bidy Exemples (noms commerciaux) à action rapide « simple » Non soluble Methylparaben Métacrésol Phénol Glycérine NaCl Na (H) PO4 Na humaines acétate. Porcine bovine Actrapid-HM, Humulin-R Actrapid, Actrapid MC-insuline par injection (URSS ne produit) l'insuline NPH (NPH) Isophane protamine m-crésol Phénol Glycérine Na (H) PO4 humaine. Porcine bovine Protafan-HM, l'insuline Humulin-N-MC Protafan protamine (URSS ne produisait plus) Lente insuline suspension de zinc (mixte). Acétate de zinc humaine NaCl Methylparaben Na. Porcine bovine Monotard-HM, Humulin-zinc Monotard-MS-MS boucle Ultra-bande de boucle de suspension d'insuline zinc (cristal). Acétate de zinc humaine NaCl Methylparaben Na. Bull Ultralente Ultra-Tartare

insuline à action rapide (CIM) de l'insuline régulière est court-soluble à un pH neutre, de l'insuline de zinc cristallin, dont l'effet se développe dans les 15 minutes après l'administration sous-cutanée et dure 5-7 heures.

La première insuline à action prolongée (IAP) a été créé dans les années 30 en retard que les patients ont pu injecter moins fréquemment qu'il utilisait seulement la CIM -. Dans la mesure du possible, une fois par jour. Afin d'augmenter la durée d'action de toutes les autres drogues et de l'insuline modifiés par dissolution dans un milieu neutre pour former une suspension. Ils contiennent une insuline protamine en zinc de tampon de phosphate de protamine et NPH (protamine neutre Hagedorn) l'insuline NPH ou différentes concentrations de zinc dans un tampon d'acétate ultralente insulines, bande, semilente.

Les préparations d'insuline de durée moyenne d'action contiennent de la protamine, une protéine de poids moléculaire moyen. 4400, riche en arginine et dérivé du lait de truite arc-en-ciel. Pour former un complexe, le rapport de la protamine à l'insuline est de 1:10. après administration sous-cutanée, les enzymes protéolytiques détruisent la protamine, ce qui permet d'absorber l'insuline.

La NPH-insuline ne modifie pas le profil pharmacocinétique de l'insuline régulatrice mélangée à celle-ci. La NPH-insuline est préférable à la bande d'insuline en tant que composant de la durée d'action moyenne dans les mélanges thérapeutiques contenant de l'insuline ordinaire.

Dans un tampon phosphate, toutes les insulines forment facilement des cristaux avec du zinc, mais seuls les cristaux d'insuline bovine ont une hydrophobie suffisante pour permettre une libération soutenue et stable de l'insuline caractéristique de l'ultra-bande. Les cristaux de zinc de l'insuline porcine se dissolvent plus rapidement, l'effet se produit plus tôt, la durée d'action est plus courte. Par conséquent, il n'existe pas de médicament ultra-puissant contenant uniquement de l'insuline porcine. L'insuline monocomposant de porc est fabriquée sous le nom d'insuline-suspension, d'insuline-neutre, d'insuline-isophane, d'insuline-aminoquinuride.

courant d'insuline est un mélange de 30% d'insuline semilente (précipité amorphe d'ions d'insuline de zinc en effet tampon acétate qui dissipe relativement rapidement) avec 70% d'insuline ultralente (peu solubles, zinc cristallin insuline ayant une apparition lente et une action prolongée). Ces deux composants offrent une combinaison d'une absorption relativement rapide de l'stable et à long agent thérapeutique durable, ce qui rend pratique la bande d'insuline.

2. Obtenir de l'insuline

L'insuline humaine peut être produite de quatre manières:

1) synthèse chimique complète;

2) extraction du pancréas humain (ces deux méthodes ne conviennent pas en raison de leur caractère non économique: développement insuffisant de la première méthode et manque de matières premières pour la production en série de la deuxième manière);

3) méthode semi-synthétique utilisant une substitution enzyme-chimique en position 30 de la chaîne B de l'acide aminé alanine dans l'insuline porcine pour la thréonine;

4) méthode biosynthétique pour le génie génétique. Ces deux dernières méthodes permettent d'obtenir de l'insuline humaine avec un degré de purification élevé.

À l'heure actuelle, l'insuline humaine est principalement obtenue de deux manières: par modification de l'insuline porcine par une méthode enzymatique synthétique et par génie génétique.

L'insuline était la première protéine obtenue à des fins commerciales en utilisant la technologie de l'ADN recombinant. Il existe deux approches principales pour obtenir de l'insuline humaine génétiquement modifiée.

Dans le premier cas, on obtient séparément (différentes souches productrices), en obtenant les deux chaînes avec le pliage ultérieur de la molécule (formation de ponts disulfure) et la séparation des isoformes.

Dans un second - l'obtention d'un précurseur (pro-insuline), suivie par la digestion enzymatique avec la trypsine B et la carboxypeptidase pour former l'hormone active. Le plus préféré actuellement est la préparation de l'insuline en tant que précurseur

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En ce qui concerne la topologie et / ou la fonction, les macrophages sont ensuite divisés en résidents, exsudatifs (macrophages d'exsudat inflammatoire), activés, induits.

Les monocytes, les macrophages et leurs précurseurs sont combinés en un système appelé phagocyte mononucléaire (CMF). La généalogie (du grec genea - naissance, origine, logos - discussion) des cellules sanguines a été très étudiée.

globules blancs et d'autres cellules de mammifères, en particulier lorsqu'ils sont infectés par des virus produisent plus d'un interféron, et plus unis dans la famille des interférons qui inhibent cycle de réplication virale productive. C'est pourquoi ils constituent la première ligne de défense contre les infections virales.

Cependant, dans les cellules conventionnelles (non induites), les interférons ne sont pas détectés. Les dimensions des molécules des interférons sont similaires en nombre au nombre d'acides aminés et de poids moléculaire, bien qu'elles soient différentes selon les autres caractères. les interférons β et γ sont des glycoprotéines, alors que l'interféron α est une protéine.

Les interférons sont des protéines cellulaires et sont donc spécifiques à chaque espèce, c'est-à-dire que chaque animal possède son propre interféron, mais n'est pas spécifique à un virus. Avec une infection virale mixte, un virus supprime l'autre en raison de l'interféronogénicité du premier - le phénomène d'interférence virale. Parfois, cette spécificité d'espèce est très étroite, par exemple pour le poulet, le canard, la souris et le rat, mais pas pour les groupes d'oiseaux et de rongeurs ou entre les groupes. Cependant, il y a des exceptions - l'interféron humain protège mieux les cellules du bétail que l'interféron de vache.

Les interférons a et ß humains sont produits principalement par les leucocytes, les lymphoblastes B et cellules d'origine mésenchymateuse des fibroblastes conjonctifs - en réponse à une infection virale. Interféron le anciennement appelé immun ou type 2; il est constitué par des cellules lymphoïdes T-lymphoblastes non revêtues en réponse à des mitogènes, et de lymphocytes sensibilisés lors d'une stimulation par des antigènes spécifiques.

interféron Superinduktsii peut être réalisée lors du traitement de cellules polyC: polyC avec cycloheximide (inhibiteur de la synthèse des protéines), et après 5 montres - ne sont toujours pas pleinement compris actinomycine D. mécanismes d'induction d'interféron et il est difficile d'expliquer pourquoi, par exemple, l'ARN double brin stimuler la formation de l'interféron et l'ADN double brin n'a pas d'effet similaire.

Dans la pratique iiterferon-α a été isolé à partir de leucocytes à une centrifugation à faible vitesse du sang humain fraîchement isolés. Leucocytes transférés dans un milieu de culture contenant soit du sérum humain ou le lait de la caséine dans le virus milieu contribuent - interferonogen (virus Sendai ou un virus de la maladie de Newcastle), mis en incubation pendant une nuit, après quoi les leucocytes sont séparés par centrifugation, le virus - interferonogen inactivé par un quelconque des modes acceptés. Le surnageant (de supernatans latine -. Flottant à la surface), ou le surnageant est un interféron natif. Il est lyophilisé et libéré dans des ampoules. Ceci est - une poudre poreuse, brun grisâtre, facilement soluble dans l'eau. médicament a une couleur Dissous de couleur rose-rougeâtre et légèrement opalescente. Parce que l'interféron natif concentré interféron peut être obtenu par purification par chromatographie sur colonne sur Sephadex. La préparation obtenue après séchage a la forme d'une poudre poreuse d'un blanc grisâtre, soluble dans l'eau. L'un et les autres interférons doivent être stériles.

L'activité des préparations est déterminée par titrage sur les cultures de cellules primaires, par exemple, du tissu musculo-squelettique de l'embryon humain avec le virus de la stomatite vésiculaire. L'activité antivirale (appelée activité spécifique) de l'interféron natif devrait être d'au moins 32 unités, concentrée - 100 unités. Pour nettoyer l'interféron, vous pouvez recourir à la chromatographie liquide hautement efficace.

P Interferrn préparé à partir de fibroblastes cultivés en culture monocouche, polii induite: polyC en présence de cycloheximide et l'actinomycine D. Typiquement, les interférons sont produits en petites quantités (environ 1 mg par 10 litres de liquide de culture de tissu) et, en outre, après 48-72 heures les cellules productrices meurent. C'est pourquoi la production d'interférons leucocytaires est classée comme coûteuse et économiquement pas très rentable.

Dans la molécule d'interféron, il existe deux domaines conservateurs - l'un localisé à l'extrémité NH 2 et l'autre à l'extrémité COOH. Le premier, évidemment, aide à se lier au récepteur à la surface de la cellule, et le second - simule cette liaison et intervient dans d'autres fonctions biologiques.

Les interférons α, β et le sont immunologiquement distincts et, par exemple, 1'a-antisérum n'inactive pas les interférons hétérologues.

Les interférons ont deux types d’activité biologique - antivirale et anticellulaire: pour les virus, l’effet de trois interférons est comparable en efficacité, mais pour les cellules, l’interféron est plus actif. le, et contre les cellules tumorales, il est plus actif que contre les cellules normales.

En pratique, les interférons sont utilisés dans les infections virales, la polyarthrite rhumatoïde (interféron, en immunopathologie et en oncologie).

41. Droits de l'hormone de croissance. Le mécanisme de l'activité biologique et les perspectives d'application dans la pratique médicale. Construction de producteurs. Obtention de la somatotropine.

La somatotropine (ou l'hormone de croissance humaine hGH) est sécrétée par l'hypophyse antérieure. Il a d'abord été isolé et purifié en 1963 de l'hypophyse. Sa carence entraîne une maladie - le nanisme hypophysaire (1 cas pour 5000 personnes). L'hormone a une spécificité spécifique. Habituellement, il est obtenu à partir du corps pituitaire des cadavres, mais en quantités insuffisantes. L'hormone ne suffit que pour traiter 1/3 des cas de nanisme hypophysaire dans les pays développés. Les principaux producteurs sont la Suède, l'Italie, la Suisse et les États-Unis. La molécule de hGH consiste en 191 résidus d'acides aminés.

La préparation des cadavres est un mélange de plusieurs formes, dont cinq ont 22 kDa, d'autres sont des dimères et le reste sont des fragments formés pendant la protéolyse. Cela a conduit au fait que chez 30% des patients ayant reçu ce médicament, les anticorps anti-hormonaux produisaient des anticorps qui annulaient leur activité biologique.

Compte tenu de cette situation, la hGH est maintenant synthétisée par des méthodes de génie génétique dans des cellules bactériennes spécialement conçues. Être synthétisé dans des cellules E. aveclje HGH contient un résidu méthionine supplémentaire sur H₂N la fin de la molécule. La biosynthèse de hGH à partir de 191 résidus d’acides aminés a été réalisée en 1979 par D. Geddel et ses collaborateurs. Tout d'abord, un ADNc double brin a été clone; de plus, par clivage, une séquence codant pour l'ordre des acides aminés de l'hormone a été obtenue, à l'exception des 23 premiers acides aminés, avec un (-NH₂) au lei (23), et un polynucléotide synthétique correspondant aux acides aminés du premier au vingt-troisième avec le codon ATG de départ au début. Ensuite, deux fragments ont été combinés et ajustés à une paire de promoteurs lac et un site de liaison au ribosome. Le rendement final en hormone était de 2,4 µg pour 1 ml de culture, soit 100 000 molécules de l'hormone par cellule. L'hormone résultante à la fin de la chaîne polypeptidique contenait un résidu méthionine supplémentaire et présentait une activité biologique significative. Depuis 1984, après des tests de toxicité clinique sérieux réalisés par Genetek (San Francisco), une production à grande échelle d'hormone de croissance bactérienne a été entreprise.

HGH dans les cellules E. aveclі et en culture cellulaire animale a été obtenue en 1982 simultanément à l'Institut Pasteur (Paris) et à l'Institut de biologie moléculaire (Moscou). Il s'est avéré que, dans les cellules bactériennes, la synthèse d'analogues holographiques est possible, à l'aide de laquelle les sites moléculaires importants pour stimuler la croissance et le processus de néoglucogenèse au niveau moléculaire ont été étudiés.

L'excrétion et la synthèse d'un polypeptide ayant une activité biologique complète présentent un grand intérêt. hypofacteur de libération de la somatotropine thalamique (STGRF). L'introduction de ce facteur est capable de compenser le manque d'hormone de croissance. Ainsi, la présence STGRF et l'hormone lui-même obtenu dans les cellules bactériennes génétiquement modifiées, il est important pour le succès du traitement des maladies causées par le manque de cette hormone, et un certain nombre de troubles pathologiques tels que certaines formes de diabète, la régénération des tissus après des brûlures, etc. Supposons que STGRF peut également être utilisé pour augmenter le poids et la croissance des animaux domestiques, car, sans espèces spécifiques, il est capable de stimuler la libération de l'hormone de croissance chez un certain nombre d'animaux.

β -Endorphine - Un opiacé du cerveau, composé de 31 résidus d'acides aminés, a été synthétisé dans des cellules génétiquement modifiées en 1980 par une équipe de scientifiques australiens et américains. La β-endorphine est obtenue dans les cellules E. aveclі sous la forme d'une protéine de fusion avec la β-galactosidase. synthèse de β-endorphine procédure comprenant les étapes consistant à: obtenir par transcription inverse de l'ARNm - ADNc codant belokpredshestvennik comprenant des séquences d'addition de la séquence de β-endorphine de ACTH et ß -lipotropina (βLTG) ensuite éliminé. La β-endorphine, obtenue à partir d'une protéine de fusion et purifiée à fond, avait une activité biologique significative. Il a spécifiquement interagi avec l'antisérum contre la β-endorphine. Β-endorphine de rendorfin humain génétiquement modifié diffère par deux acides aminés, et ces différences peuvent être facilement éliminé au niveau du nucleotide par substitution de deux codons dans l'ADN du plasmide bactérien.

42.Production de préparations enzymatiques. Enzymes utilisées comme médicaments. Méthodes traditionnelles d'obtention de préparations enzymatiques.

La microencapsulation ouvre des perspectives intéressantes pour l'utilisation d'un certain nombre de médicaments, par rapport à leur utilisation sous la forme de formes posologiques classiques.

L'utilisation de microcapsules ne se limite pas à l'objectif d'une thérapie médicamenteuse. Une direction prometteuse dans le domaine de la technologie est la production de microcapsules avec des solutions de protéines, des enzymes microencapsulées, des antidotes. L'application d'enzymes microencapsulées - l'uréase, l'uricase, la trypsine - est étudiée. Par exemple, des microcapsules à l'uréase par administration intraperitoneale provoque une augmentation de la concentration d'ammoniaque dans le sang, après quoi l'urée commence à diffuser à partir du sang dans la cavité intraperitoneale, puis dans des microcapsules en subissant une nouvelle conversion en ammoniac. La microencapsulation permet également de protéger les enzymes de l'inactivation du fait de la formation d'anticorps-immunoglobulines lors de l'injection.

Activation d'enzymes dans des microcapsules. des enzymes de microencapsulation est de les inclure dans des solutions aqueuses de membrane semi-perméable d'environ 20 nm d'épaisseur, imperméable à la DIU et de cellules, mais à travers laquelle de petites molécules peuvent pénétrer. Disponibilité de la membrane ultramince pour créer une forte concentration fer-ment dans de petits volumes de solution contenue dans la microcapsule, et de maintenir la stabilité et l'activité biologique de l'enzyme encapsulée. Utilisation de l'enzyme à des concentrations élevées et de grandes valeurs du rapport de la surface au volume des microcapsules fournissent une diffusion rapide du substrat de faible poids moléculaire à partir de l'environnement extérieur à l'enzyme et le produit à partir du volume interne des microcapsules dans l'espace de mezhkapsulyarnoe.

Des formes microencapsulées d'un certain nombre d'enzymes catalysant diverses transformations de substrats de faible masse moléculaire ont été obtenues et étudiées. Ainsi, micro-encapsulé catalase perfusion intraveineuse ou intrapéritonéale à des souris avec la synthèse de trouble héréditaire de l'enzyme, réduit efficacement le contenu de perborate dans le sang et avait une période plus longue dans le orgainzme de vie que l'enzyme libre. Microencapsulé asparaginase introduit des souris avec des tumeurs induites asparaginzavisimymi réduction persistante et prolongée de l'asparagine dans le sang, empêchant ainsi la croissance de néoplasmes malins. L'uréase microencapsulée après administration à des rats dans le tractus gastro-intestinal a provoqué une diminution significative du contenu urinaire dans le sang. Il convient de noter que toutes les études d'enzymes microencapsulées sont effectuées uniquement sur des animaux. Cela est dû au fait que lorsqu'ils sont administrés intracorporelle matériau utilisé pour fabriquer des membranes est accumulée principalement dans le foie et la rate et ne peut être indifférent au corps.

Le matériau idéal du point de vue de l'utilisation biologique des microcapsules chez l'homme et chez l'animal peut être diverses membranes naturelles de cellules sanguines. Enzyme dans des conditions relativement douces (force neutre, ionique et petit t. Q.) peut-il être enfermé dans des cellules de sang partiellement hémolysés (érythrocytes, plaquettes), suivie d'une réduction de leur intégrité membranaire. Étant donné que la taille des éléments enzymatiques du sang est faible, et leur durée de vie dans la circulation sanguine est relativement importante, ces microcapsules peuvent circuler librement et de façon permanente dans le sang. Les cellules sanguines comprennent des enzymes telles que la glucosidase, la galactosidase, l'amylase, de la peroxydase, l'arginase, asparaginase, et d'autres. Toutes les enzymes immobilisées dans les cellules sanguines ont des paramètres catalytiques immuables et sont plus résistantes à l'augmentation de la température.

L'utilisation de microcapsules contenant des enzymes par voie extracorporelle à travers des shunts ou des chambres a une bonne perspective. L'un des avantages est qu'il n'y a pas de contact de l'enzyme avec les cellules immunitaires, éliminant ainsi la possibilité de sensibilisation de l'organisme avec toutes les conséquences néfastes. De plus, l'application à l'extérieur du corps exclut l'accumulation de cellules artificielles et élimine le problème de la destruction et de l'utilisation des matériaux polymères. En raison de la membrane semi-perméable ultramince et une valeur élevée du rapport de l'aire de surface à volume de microcapsules, le taux de diffusion de substances de faible poids moléculaire à travers des microcapsules supérieures à une membrane de dialyse dans l'appareil de « rein artificiel ». Le principe de la conversion enzymatique de métabolites nuisibles en utilisant des enzymes microencapsulées développés pour une utilisation dans l'appareil de « rein artificiel » et « foie artificiel ». L'utilisation d'enzymes microencapsulées pour éliminer l'urée, l'un des métabolites les plus toxiques de la cellule, peut être prometteuse. L'une des méthodes consiste à convertir l'urée sous l'action de l'uréase microencapsulée en ammonium et en dioxyde de carbone. La seconde est l'utilisation d'un shunt extracorporel équipé de microcapsules avec des complexes de recyclage multienzymatiques.

D'un grand intérêt est l'utilisation de microcapsules ayant une peau de polyuréthanne, contenant des suspensions aqueuses antidotes: charbon actif, les résines échangeuses d'ions et d'autres composés sont caractérisés par la capacité à se lier et à inactiver les substances toxiques générées et la circulation sanguine au cours du métabolisme. La purification de ces substances du sang est effectué avec des machines spéciales, des récipients contenant des microcapsules à la circulation sanguine ekstrakoriaralnoy. Dans ce cas, le sang est également libéré de l'ammoniac. Un tel système peut être utilisé efficacement dans le traitement d'un certain nombre de maladies rénales.

Les enzymes immobilisées ont une grande importance pour la médecine. En particulier, les enzymes thrombolytiques, conçues pour lutter contre les maladies cardiovasculaires, occupent un grand marché. Ainsi, dans la pratique clinique nationale, le médicament "streptodécase" contenant de la streptokinase - un activateur du précurseur de la protéinase plasmine empêchant la formation d'un thrombus dans le système circulatoire a été introduit.

enzymes dégradantes, certains acides aminés essentiels (par exemple, l'asparaginase) est utilisé pour contrôler la croissance des tumeurs cancéreuses. Les enzymes protéolytiques (trypsine, la chymotrypsine, la subtilisine, la collagénase) immobilisée sur les matériaux fibreux, est utilisé pour le traitement efficace des plaies, des ulcères, des brûlures, des abcès et de leurs inhibiteurs protéiques (cellulose, des fibres de polyamide, de dextrane, etc..) - dans la thérapie de remplacement pour le traitement de emphysème et pancréatite.

Exceptionnellement important d'un point de vue pratique, des travaux consacrés au transport directionnel de substances médicamenteuses. A cet égard, les enzymes encapsulées telles qu'une cellule artificielle sont particulièrement avantageuses. Ainsi, les microcapsules, les parois sont présentées gaine érythrocytaire ( « ombre érythrocytaire ») et leur contenu sont remplis enzyme asparaginase transféré le flux sanguin vers les zones d'accumulation de asparagine et ainsi asparaginzavisimyh utilisé pour traiter les tumeurs, en particulier sarcomes. Colonnes microcapsules remplies d'une enzyme utilisée pour la dialyse dans l'appareil « rein artificiel », qui fonctionne à 100 fois plus efficace que les appareils conventionnels.

Ainsi, l'utilisation d'enzymes immobilisées dans de nombreuses branches vitales de l'économie nationale devient de plus en plus massive. La combinaison avantageuse de sélectivité et d'efficacité avec la durabilité et la stabilité des enzymes immobilisées contribue à la création de nouveaux procédés et thérapies biotechnologiques, améliore le diagnostic médical, l'analyse, la synthèse organique et a un impact énorme sur le mode de vie d'une personne.

43. Biotechnologie des acides aminés. Les avantages de la synthèse microbiologique par rapport aux autres méthodes de préparation. Principes généraux de la conception de souches de microorganismes - producteurs d'acides aminés en tant que métabolites primaires.

Les acides aminés - le principal matériau de construction du corps, à partir duquel se forment les peptides et les protéines. Les plantes et les micro-organismes sont capables de synthétiser tous les acides aminés dont ils ont besoin à partir de composés chimiques plus simples. Cependant, l'organisme humain est capable de synthétiser seulement 12 des 20 acides aminés nécessaires à la vie de lui. Les 8 acides aminés restants sont appelés irremplaçables et doivent pénétrer dans l’organisme de l’extérieur - avec de la nourriture. Avec une pénurie d'au moins un des acides aminés essentiels du corps ralentit la croissance, se manifeste la pathologie. Il est donc important de synthétiser ces acides aminés à l'échelle industrielle pour ajuster les régimes, à des fins thérapeutiques et prophylactiques, etc... En outre, les acides aminés (tels que remplaçable et essentiel) sont une matière première importante pour de nombreux procédés biotechnologiques et la logique.

La production de nombreux acides aminés, y compris les acides aminés indispensables, est une branche importante de l'industrie chimique. Cependant, en utilisant des méthodes chimiques, on obtient un mélange d’isomères optiques d’acides aminés, autrement dit un mélange L- et D-acides aminés, dont les molécules dans L- et la forme D sont des isomères miroir. Dans les réactions chimiques tels isomères pratiquement impossibles à distinguer odiako corps humain utilise uniquement les acides L-aminés (à l'exception de la methionine). Pour la plupart des procédés biotechnologiques acides aminés D sont également sans valeur.

Séparation du mélange L- et les acides D-aminés, que l'on appelle des mélanges racémiques en leurs isomères processus constituant a été le premier dans le monde osushestvlennym en utilisant des enzymes immobilisées à l'échelle industrielle. Ce processus a été mis en œuvre au Japon à l'usine appartenant à la société « Tanabe Ceillac » en 1969. Au cours des 15 dernières années, ce processus a été réalisé avec l'utilisation de l'enzyme soluble - aminoacylase, mais il n'a pas été économique (I. Chibata, 1976). Après la transition vers immobilisé Aminoacylase l'efficacité économique du processus a augmenté une fois et demi, et maintenant la société porte sur la production à l'échelle industrielle de cinq L-aminokielot, dont quatre sont essentiels (méthionine, valine, phénylalanine, tryptophane).